羊传染性脓疱病毒NZ2毒株CBP 蛋白结构分析与表位预测

成伟伟，陈伯祥，常攀峰，杨 明，赵子惠

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000）

羊传染性脓疱是由羊传染性脓疱病毒（ORFV）感染山羊和绵羊，在其嘴唇部皮肤形成脓疱或结成厚痂的一种人兽共患传染病[1]。该病主要在3月龄左右的羔羊和部分免疫力下降的成年羊中流行，可导致感染羔羊死亡、成年羊生产性能下降[2]。该病也可感染人，使人的手部皮肤出现溃疡甚至坏死[3-4]。因而该病既影响养羊业健康发展，也威胁人们身体健康。

ORFV 的ORF112基因编码的CBP 蛋白是趋化因子结合蛋白，含有286个氨基酸残基[5]。ORF112基因长约861 bp。CBP 蛋白能够竞争性地结合趋化因子，阻止G 蛋白偶联受体与趋化因子结合，从而抑制宿主的免疫反应。有研究[6]表明，敲除ORF112基因，对ORFV 的致病性有明显影响。然而其具体机制并不清楚，CBP 蛋白是否还具有其他功能也不清楚。所以，本研究以ORFV NZ2毒株的CBP 蛋白氨基酸序列为研究对象，应用生物信息学方法，对CBP 蛋白的理化特性、亲水性、跨膜区、信号肽、二级结构、三级结构、B 细胞表位和T 细胞表位进行预测分析，以期为CBP 蛋白的功能研究和ORFV 的致病机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 氨基酸序列

选 取GenBank 中ORFV NZ2毒株的CBP 基因序列（序列号为ABA00630），运用Editseq 软件翻译成CBP 蛋白的氨基酸序列，序列如下：

1.2 方法

运用在线工具ProtParam，分析CBP 蛋白的理化特性[7]；利用DNAstar 软件中的KyteDolittle方法，预测CBP 蛋白的亲水性和疏水性；利用在线软件TMHMM 和SingnalIP，预测CBP 蛋白的跨膜区和信号肽[8]；利用DNAstar 软件，预测分析CBP 蛋白的二级结构[9-10]；将CBP 蛋白的氨基酸序列提交Swiss-Model，使用RasMol 分析软件构建OVIFNR 蛋白的三级结构模型[11]；运用在线ABCpred 工具和DNAstar 软件，预测CBP 蛋白B细胞表位[12-13]，并综合分析单参数预测结果，筛选出优势B 细胞表位；分别运用在线服务器nHLAPred 和在线软件SYFPEITHII，预测CBP 蛋白所含的HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203三种MHC-I 结合肽段，并结合两种方法预测出的结果，筛选出优势CTL 表位[14]；分别使用在线服务器ProPred 和在线软件SYFPEITHI，预测CBP 蛋白所含的HLA-DRB1*0101、HLADRB1*0102、HLA-DRB1*0301三种MHC-II 结合肽段，然后结合两种方法预测出的结果，筛选出优势Th 表位[15]。

2 结果

2.1 CBP 蛋白的理化特性预测分析

CBP 蛋白的理化特性预测分析结果显示，CBP 蛋白的分子式为C1357H2155N367O451S11，相对分子质量为31.179 89 kDa，理论等电点为4.68，半衰期为30 h，稳定系数为43.06，脂肪族指数为81.78，总平均亲水性为-0.383。

2.2 CBP 蛋白的亲疏水性预测分析

CBP 蛋白的亲水性和疏水性预测结果（图1）显示，CBP 为亲水性蛋白，其亲水性区域主要位于19～62、71～90、119～125、132～158、165～184、188～220、242～290位氨基酸区域。

2.3 CBP 蛋白的跨膜区和信号肽预测分析

图1 CBP 蛋白亲水性预测结果

CBP 蛋白的跨膜区预测结果（图2）显示，CBP 蛋白无跨膜区，其1～286个氨基酸残基全部在膜外。CBP 蛋白信号肽预测结果（图3）显示，CBP 蛋白存在潜在的信号肽，位于1～15位氨基酸残基处，在16～17位处存在剪切位点。

2.4 CBP 蛋白的二三级结构预测分析

图2 CBP 蛋白跨膜区预测结果

图3 CBP 蛋白信号肽预测结果

CBP 蛋白的二级结构的预测结果（图4）显示：CBP 蛋白的二级结构中主要包括α 螺旋、β 折叠、β 转角和无规卷曲4种类型，所占比重分别为α 螺旋38.11%、β 折叠33.91%、β 转角5.94%、无规卷曲10.48%；CBP 蛋白的α 螺旋主要位于1～24、27～35、39～48、67～95、155～163、235～245、251～253、260～273，β 折叠主要位于49～57、63～66、96～114、122～131、136～143、151～154、182～189、206～212、217～227、229～234、246～250、276～281，β 转角主要位于58～61、146～148、166～169、175～177、198～200，无规卷曲主要位 于36～38、117～121、132～134、170～172、178～181、190～195、201～203、282～284。使用在线软件Swiss-Model 构建的CBP 蛋白三级结构模型如图5所示。

图4 CBP 蛋白二级结构预测结果

图5 CBP 蛋白三级结构同源建模

2.5 CBP 蛋白的B 细胞表位预测分析

利用DNAstar 软件对CBP 蛋白的柔性区域、抗原指数和表面可及性进行预测，结果如图6所示；运用在线软件ABCpred 预测CBP 蛋白B 细胞表位，结果如表1所示。将β 转角、无规卷曲、亲水性区域、柔韧性区域、抗原指数和表面可及性区域的预测结果作为CBP 蛋白B 细胞表位预测的参数，结合ABCpred 预测结果，综合筛选出CBP 蛋白优势B 细胞表位，结果筛选出CBP 蛋白优势B 细胞表位6个，分别是17～27、21～31、74～84、81～91、118～128、132～142（表2）。

2.6 CBP 蛋白的T 细胞表位预测分析

图6 CBP 蛋白的柔韧性区域、抗原指数和表面可及性预测结果

表1 ABCpred 预测CBP 蛋白B 细胞表位

运用在线服务器nHLA-Pred 对CBP 蛋白所含的HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203三种MHC-I 结合肽段的预测结果见表3，利用在线软件SYFPEITHII 对CBP 蛋白CTL 表位进行预测，预测结果见表4。结合两种方法的预测结果，筛选出CBP 蛋白的3个优势CTL 表 位，分别为4～13位 的VLLLALLGA、65～74位 的CMLDIEDSV 和120～129位 的SLEDSYLYV。

表2 综合筛选CBP 蛋白优势B 细胞表位

使用在线服务器ProPred 预测CBP 蛋白HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0102和HLADRB1*0301三种MHC-II 结合肽段，未预测出MHC-II 结合肽段；运用在线软件SYFPEITHI 预测CBP 蛋白的MHC-II 结合肽段，也未预测出MHC-II结合肽段。两种预测的结果表明，CBP 蛋白可能不含Th 细胞表位。

表3 nHLA-Pred 方法对CBP 蛋白CTL 表位的预测结果

表4 SYFPEITHI 方法对CBP 蛋白CTL 表位预测

3 讨论

通过生物信息学软件预测出CBP 蛋白的理论等电点为4.68。蛋白质所处环境的pH 大于理论等电点时，蛋白质带负电，小于理论等电点时，蛋白质带正电[16-17]。而CBP 蛋白在ORFV 感染宿主的早期表达中，宿主体内的pH 约为7.0左右，所以该蛋白在宿主体内带负电；该蛋白的稳定系数为43.06，说明该蛋白不太稳定。蛋白质的稳定性与其特定的氨基酸序列、剪切加工及空间结构都有密切的关系。蛋白质是否为亲水性蛋白主要取决于其分子表面的电荷量。CBP 蛋白虽为亲水性蛋白，但较强的亲水性区域较少，说明该蛋白形成抗原表位方面的能力不足。在线软件SingnalIP 预测结果表明，CBP 蛋白存在潜在的信号肽，有信号肽的蛋白大多被分泌到膜外发挥作用；而在线软件TMHMM 预测结果表明，CBP 蛋白无跨膜区，1～286个氨基酸残基全部在膜外。这两种预测结果充分说明，CBP 蛋白被运输到膜外发挥作用。

CBP 蛋白的二级结构预测表明，β 转角和无规卷曲所占比重较小，说明该蛋白不易形成抗原表位；而CBP 蛋白的表位预测结果也说明了这一点，CBP 蛋白预测出的细胞表位较少。Swiss-Model 是基于同源建模的方法构建蛋白质三级结构，是目前三级结构预测中最好的预测工具之一，构建出的三级结构具有更高的准确性。蛋白质三维结构的构建有助于对蛋白质功能的认识。本研究构建的CBP蛋白的三维结构形似倒立的哑铃状，上下两部分比较对称。本研究在CBP 蛋白B 细胞表位预测方面，将β 转角、无规卷曲、亲水性区域、柔韧性区域、抗原指数和表面可及性区域的预测结果作为参数，并结合 ABCpred 预测结果筛选CBP 蛋白的B 细胞表位，这样筛选出的CBP 蛋白B 细胞表位具有更高的可信度。在CTL 细胞表位预测方面，结合了nHLA-Pred 和SYFPEITHII 两种方法预测的结果，在Th 细胞表位预测方面，结合了ProPred 和SYFPEITHII 两种方法预测的结果，所以预测出的CBP 蛋白T 细胞表位具有更高的可靠性。本研究筛选出CBP 蛋白优势B 细胞表位6个、CTL 细胞表位3个，未预测出Th 细胞表位。这样CBP 蛋白较少的细胞表位与CBP 蛋白二级结构中β 转角和无规卷曲所占比重较小相互印证。本研究在B 细胞表位预测上与黎摄儿等[18]对ORFV 湖北分离株的CBP 蛋白B 细胞表位预测结果基本一致，但在T 细胞表位预测上差异较大。这可能与ORFV 各毒株间的差异有关。CBP 蛋白未预测出Th 细胞表位，说明该蛋白可能在ORFV 逃避宿主免疫反应过程中发挥了作用。

本研究仅运用生物信息学方法对ORFV NZ2毒株CBP蛋白的结构与细胞表位进行了分析预测，因受条件限制，尚未对得到的结果和结论进行实验验证，但该仍可为CBP 蛋白的功能研究与ORFV的致病机制研究提供一定的参考。