应用不同基因检测方法分析假肥大型肌营养不良基因的变异特点

康 娟，邓艳春

假肥大型肌营养不良症(pseudohypertrophy muscular dystrophy)是最常见的遗传性肌肉疾病，包括杜兴型肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy，DMD)和贝克型肌营养不良症(becker muscular dystrophy，BMD)，二者均是由编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin，也称DMD基因)基因突变所致的X-连锁隐性遗传病[1，2]。假肥大型肌营养不良症患者由于抗肌萎缩蛋白缺乏导致了骨骼肌细胞膜缺陷，细胞内的肌酸激酶等外漏，肌细胞坏死、脂肪组织和纤维结缔组织增生[3]。临床表现为骨骼肌的进行性萎缩、无力、腓肠肌假性肥大。其中DMD的发病率约占活产男婴的1/3500[2]。此型患者通常于4～5岁表现出双下肢运动乏力，呈进行性加重，8～12岁丧失行走能力，20岁左右死于呼吸衰竭或心力衰竭；BMD发病率约为1/12000[4]，症状较轻，部分患者从16岁丧失行走能力，少数到50岁、60岁才出现临床症状，病情严重程度不等[5]。目前国际上关于DMD/BMD的基因治疗取得突破性进展，如通过输注反义寡核苷酸诱导外显子跳跃而纠正读框移位，或在翻译过程中抑制无义突变等方法[6～9]，尽早明确临床DMD/BMD诊断，为及时进行基因治疗及综合治疗提供条件。目前临床基因检测方法较多，合理选择检测方法，利于高效、经济、准确为临床提供验证，DMD/BMD的基因诊断多采用多重连接探针扩增技术 (multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)，快速分析患者DMD/BMD基因缺失突变/重复突变，外显组测序 (Exome sequencing) 补充点突变及拷贝数检测，Sanger测序可用于点突变验证[10～12]。本研究，我们合理选择上述方法，对10例 DMD/BMD患者进行了基因突变分析。

1 对象与方法

1.1 对象 我们通过收集2016～2019年我科10例临床诊断DMD/BMD患者的临床资料，知情同意后，选择性应用MLPA、外显组测序及Sanger测序技术，从基因水平验证临床诊断。临床纳入标准：(1)临床表现有进行性肌无力，以肢体近端为著，腓肠肌肥大，查体有Gower征阳性；(2)心肌酶谱化验：肌酸激酶升高，正常值的数十倍及以上，并排除心脏和肝脏疾病；(3)肌电图或肌肉活检提示肌源性损害。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 在知情同意的前提下，采集患者外周静脉血2 ml于EDTA抗凝管中。使用BloodGen Midi Kit (CWBIO，中国) 试剂盒按照说明书进行提取患者全基因组DNA。

1.2.2 MLPA分析 SALSA MLPA探针组 P034-B2/P035-B1 DMD试剂盒购自荷兰MRC-Holland公司 。用 TE溶液稀释DNA样本至 40 ng/μl，取 5 μl DNA样本，依据试剂盒说明进行DNA变性、杂交、连接、PCR扩增；扩增产物在ABI 3130中进行毛细管电泳；应用 Genemapper4.0软件和 Coffalyser软件进行分析。

1.2.3 外显组测序 将先证者全血使用全基因组DNA提取盒(天根DP349，北京)按照产品说明提取基因组DNA，取1 μg DNA 经Cavoris仪(美 国 Covaris公 司 )将其打断至200 bp左右，DNA片段在Klenow Fragment、T4 聚合酶和T4多核苷酸激酶的作用下末端补平修复，其3’端加上A，连接接头，形成标准的Solexa测序文库，文库扩增，与探针杂交，使用链霉素磁珠与杂交样本孵育后洗脱，洗脱产物扩增，经Illumina Hiseq2500平台标准化上机测序。

1.2.4 生物信息学分析 经Illumina官方basecall分析软件BclToFastq得到原始数据，去除低质量的数据后，利用BWA(Burrows wheeler aligner)将读序与人类基因组参考序列(UCSC，Hg19)比对，再分别使用经分析软件 samtools和pindel进行SNP和Indel的过滤筛选，获得高质量可靠的突变。

1.2.5 Sanger法验证 按照常规的Sanger法对例9 和例10患者的2个点突变进行测序验证。扩增引物如下，例9样本扩增引物为：DD18003793_NNmDeF：TGAGTAGCATATTCCCGTGTCCA，R：CAGAGAACACTCCCCATATCCC；片段长度778bp；例10样本扩增引物基因DMD-Ex6-seq-F：AATCAGAATAGACTCCTAGCCTT，DMD-Ex6-seq-R：ACTATAACCACTTTCACGCTCC。片段长度599 bp。二者退火温度均为60度。

2 结 果

2.1 MLPA分析结果 应用 MLPA 技术对10例患者血液进行检测，其中8例检测到外显子缺失突变，具体如下：例1外显子46～52缺失，例2外显子 45～46、49缺失，例3外显子 45～47缺失，例4外显子 44～55缺失，例5外显子45～47缺失，例6外显子17～44缺失，例7 外显子17～44缺失，例8外显子17～44缺失(见表1)，本组中未发现外显子重复突变病例。

2.2 外显组测序 应用外显组测序结果及生物信息学分析高通量测序结果显示，例9为非编码区突变c. 6832-26(IVS49) G>A，例10为点突变c. 116(exon6) G>T(见表2)，例9和10同时发现存在其他基因变异，因与患者临床表型无相关性，所以这些基因变异暂不考虑与DMD/BMD的致病性有关。

2.3 突变验证采用Sanger法 对例9～10相应的突变位点进行测序验证。Sanger法测序与外显组测序结果一致 (见图1) 。

表1 8例BMD/DMD患者基因缺失结果

表2 2例外显组及Sanger测序结果

图1

图2

3 讨 论

DMD基因是人体最大的基因之一，位于Xp21.2，全长2400 kb，含79个外显子，78个内含子[6，13]。DMD基因最常见的突变类型为外显子缺失，约占55%～65%，外显子重复突变为5%～10%，其余为点突变或微缺失、插入及剪切位点突变等。致病点突变一般为无义突变或移码突变[14]。

在本研究中，10例患者有8例外显子缺失突变，其中缺失外显子集中于第 44～55外显子 (见表1)，该热点区域与多个文献中报道一致[10，15]。1988年报道指出DMD/BMD多为肌肉组织中抗肌萎缩蛋白(dystrophin)严重不足或缺如，而BMD患者则为抗肌萎缩蛋白部分缺乏或分子量异常，因此，BMD较DMD病情较轻[16]。在本研究中，结合临床表型，10例患者中有7例诊断DMD，3例诊断BMD。

在MLPA结果为阴性的2例患者中，我们应用外显组测序发现了2种新发点突变，其中例9为非编码区突变c. 6832-26(IVS49) G>A，其致病性尚不明确，例10为点突变c. 116(exon6) G>T，ACMG等级为“致病”。该两点突变尚未见报道。但其例9，男，24岁，双下肢无力15 y，蹲下起立困难，尚可独立行走，鸭步，Gower阳性；例10，男，63岁，双下肢无力20 y余，近端肢体无力为主，鸭步，其表型符合BMD。此外，例9和10同时发现其他基因变异，因与患者临床表型不符，所以这些基因变异暂不考虑与BMD发病有关。

MLPA和Sanger测序分别被认为是检测基因外显子变异和点突变的“金标准”，然而需要事先确定测序的靶向位点以及检测范围有限，限制了其在临床上的广泛应用。目前，高通量、快速并且已广泛应用于临床的NGS已能够用于DMD的点突变检测[10，11]。在临床上，诊断DMD/BMD时，临床表现为肢体无力，体征有腓肠肌肥大、Gower征阳性，化验肌酶升高，尤其是肌酸激酶高出数十倍，肌肉活检可见肌纤维大小不等，可见肌纤维坏死，抗肌萎缩蛋白免疫组化染色在DMD/BMD患者的肌膜表达完全缺失或部分缺失。基于上述情况，我们可以进行基因检测：首先选择MLPA对患者DMD基因进行缺失/重复突变筛查；对于MLPA检测为阴性者，应用外显组测序，发现点突变和微小突变，并Sanger测序进行验证。以此，规范DMD/BMD基因诊断流程。为患者提供遗传咨询，更为患者日后选择基因治疗做好准备。