维药洋甘菊化学成分及DPPH自由基清除活性研究

叶 琦，汪 洋，李思婵，梅 艳

华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院，武汉430000

洋甘菊(MatricariachamomillaL.)为菊科(Compositae)母菊属(Matricaria)一年生草本植物[1]，又名德国洋甘菊或母菊，维吾尔医药又称巴布那儿、巴木乃[2]，其味微苦、甘香，具有明目、退肝火、祛痰止咳的作用，可有效缓解支气管炎及气喘、抑制真菌、消炎解痉[3,4]，为《国家药品标准维吾尔药分册》所收藏。原产于地中海东部流域和亚洲西北部地区，古埃及和希腊人常用它作药物，是一种重要的药用植物和香料资源，它的干燥头状花序已成为一种重要的出口物资。作为一种民族常用药，洋甘菊在此前的研究中已发现其化学成分主要包括挥发油类、黄酮类、香豆素类、有机酸类等[5,6]。为更好地开发利用我国的洋甘菊资源，我们对新疆产洋甘菊头状花序的化学成分进行了研究，从其75%醇提取物中分离得到11个化合物，通过波谱方法分别鉴定为分别为山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(1)、木犀草素-3′-O-β-D-葡萄糖苷(2)、6-羟基木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(3)、异槲皮苷(4)、5-羟基-4′，7-二甲基-6,8-二甲氧基黄酮(5)、槲皮素-3′-O-β-D-葡萄糖苷(6)、3-羟基苯甲醇(7)、1-(4-羟基苯基)乙烷-1，2-二醇(8)、2-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-丙烷 -1，3-二醇(9)、2-(4-羟基乙基)-乙醇(10)、丁香酸(11)。其中化合物1～3，5，7～11为首次从该植物中分离得到，体外活性测试结果显示化合物1、2、3、5、6具有较好的清除自由基作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

柱色谱硅胶(200～300目、300～400目)及薄层色谱硅胶G、H(青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20(瑞典Pharmacia公司)；ODS(40～60 μm)(美国Sepax Technologies)；甲醇、乙腈(均为色谱纯)(美国Honeywell公司)；DPPH试剂(美国Sigma公司)；Vitamin E、二甲基亚砜等化学试剂(国药集团化学试剂有限公司)，实验用水为超纯水。

1.2 仪器

AVANCEIII-600型核磁共振仪(德国Bruker公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；戴安U-3000型半制备液相色谱仪(美国戴安公司)；半制备色谱柱RP18(250 mm×20 mm，5 μm)(日本YMC公司)；EYELAN 1000型旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会)；KQ-100DA型数超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)； WD-9405B 型水平摇床(沃德生物医学仪器公司)；Melab-U/4C501H 型生物信号采集系统(南京美易科技有限公司)。

1.3 药材

洋甘菊购自于九州通中药材有限公司，由武汉市第一医院余南才主任药师鉴定为菊科(Compositae)母菊属(Matricaria)植物洋甘菊(MatricariachamomillaL.)。

2 实验方法

2.1 提取分离实验

将洋甘菊5 kg加10倍体积的75%乙醇回流提取，每次1小时，将提取液过滤浓缩，得浸膏约1 L，用水分散后，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩，得到乙酸乙酯浸膏330 g，水层部分浓缩后经大孔树脂D101，水洗至无色后用75%乙醇洗，收集洗脱液回收有机溶剂，得到浸膏120 g。取部分浸膏(100 g)进行硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇-水梯度洗脱(10∶1∶0→70∶30∶5)，收集流份，采用TLC检测，10%硫酸-乙醇喷雾加热显色，合并相同组分，经ODS、LH20柱色谱及半制备HPLC等方法进行分离纯化，得到化合物1(13 mg)、2(15 mg)、3(17 mg)、4(130 mg)、5(21 mg)、6(28 mg)、7(11 mg)、8(36 mg)、9(24 mg)、10(17 mg)、11(19 mg)。

2.2 DPPH自由基清除实验

将化合物1～11分别配制浓度为 6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L甲醇溶液，作为实验组。同时配制200 μmol/L的维生素E(Vitamin E)作为对照组。将不同浓度的样品溶液100 μL 和DPPH(1 mmol/L)溶液 100 μL于96孔酶标板中，加入样品后振荡 30 s，在 37 ℃、 517 nm 波长下测定其吸光度值(Ap)；同时测定不加 DPPH 的样品空白吸光度值(Ac)和加 DPPH 但不加样品(以 100 μL甲醇代替样品)的吸光度值(Amax)[7]，实验重复3次，并按公式和回归方程分别计算自由基清除率和半数清除率(IC50)。实验结果见表1。

DPPH清除率=1-(Ap-Ac)/Amax

3 实验结果与讨论

化合物1黄色结晶性粉末(MeOH)；可溶于甲醇、乙醇等溶剂；1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：12.68(1H，brs，5-OH)，6.28(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.53(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，8.04(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，5.40(1H，d，J=6.6 Hz，H-1″)；13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：177.4(C-4)，164.1(C-7)，161.1(C-5)，160.0(C-4′)，156.3(C-2)，156.2(C-9)，133.4(C-3)，130.9(C-2′，6′)，120.8(C-1′)，115.1(C-5′)，115.0(C-3′)，104.0(C-10)，100.8(C-1″)，98.7(C-6)，93.6(C-8)，77.4(C-5″)，76.4(C-3″)，74.1(C-2″)，69.8(C-4″)，60.8(C-6″)。以上数据与文献[8]报道一致，故鉴定化合物1为山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物2淡黄色粉末(MeOH)；1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：7.84(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，7.61(1H，dd，J=9.0，2.4 Hz，H-6′)，7.01(1H，d，J=9.0 Hz，H-5′)，6.55(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.4 Hz，H-6)，4.94(1H，d，J=7.6 Hz，H-1″)；13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：181.9(C-4)，164.3(C-2)，163.8(C-7)，161.4(C-5)，157.3(C-9)，150.6(C-4′)，145.7(C-3′)，121.9(C-6′)，121.8(C-1′)，116.4(C-5′)，114.3(C-2′)，103.7(C-10)，103.4(C-3)，101.8(C-1″)，98.9(C-6)，93.9(C-8)，77.4(C-5″)，76.1(C-3″)，73.1(C-2″)，70.1(C-4″)，60.9(C-6″)。以上数据与文献[9]报道一致，故鉴定化合物2为木犀草素-3′-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物3淡黄色粉末(MeOH)；1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：12.88(1H，s，5-OH)，7.81(1H，d，J=7.2 Hz，H-6′)，7.36(1H，s，H-2′)，6.98(1H，s，H-8)，6.88(1H，d，J=6.6 Hz，H-5′)，6.67(1H，s，H-3)，5.03(1H，d，J=5.4 Hz，H-1″)，3.82(2H，d，J=10.2 Hz，H-6″)，3.49～3.30(4H，m，sugar-H)；13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：155.8(C-2)，114.5(C-3)，183.1(C-4)，146.7(C-5)，130.6(C-6)，151.2(C-7)，94.3(C-8)，149.8(C-9)，106.5(C-10)，122.4(C-1′)，113.8(C-2′)，146.3(C-3′)，150.1(C-4′)，116.7(C-5′)，120.0(C-6′)，102.1(C-1″)，73.7(C-2″)，77.2(C-3″)，70.6(C-4″)，76.9(C-5″)，61.7(C-6″)。以上数据与文献[10]报道一致，故鉴定化合物3为6-羟基木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物4黄绿色粉末(MeOH)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.88(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，7.86(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.98(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.57(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.32(1H，d，J=2.4 Hz，H-6)，5.34(1H，d，J=7.8 Hz，H-1″)，3.82(1H，dd，J=3.0，2.4 Hz，H-6″α)，3.68(1H，dd，J=6.0，5.4 Hz，H-6″β)，3.59～3.30(4H，m，sugar-H)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：178.8(C-4)，166.5(C-7)，163.1(C-5)，159.7(C-2)，158.6(C-9)，150.2(C-4′)，146.3(C-3′)，136.0(C-3)，123.5(C-6′)，123.4(C-1′)，117.9(C-5′)，116.3(C-2′)，106.1(C-10)，104.7(C-1″)，100.0(C-6)，95.1(C-8)，78.7(C-5″)，78.2(C-3″)，71.6(C-2″)，63.0(C-4″)，60.9(C-6″)。以上数据与文献[11]报道一致，故鉴定化合物4为异槲皮苷。

化合物5黄色针状结晶(MeOH)；1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：13.03(1H，s，5-OH)，8.07(2H，s，H-2′，6′)，7.15(2H，s，H-3′，5′)，6.97(1H，s，H-3)，3.86、3.76(3H，each，-OCH3)，2.35、2.10(3H，each，-CH3)；13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：182.8(C-4)，163.8(C-7)，162.5(C-4′)，162.2(C-2)，156.3(C-5)，152.4(C-9)，128.4(C-2′，6′)，123.1(C-1′)，114.8(C-3′，5′)，113.3(C-6)，108.9(C-8)，106.7(C-10)，103.3(C-3)，60.5、55.7(4′，7-OCH3)。以上数据与文献[12]报道一致，确定化合物5为5-羟基-4′，7-二甲基-6，8-二甲氧基黄酮。

化合物6黄色针状结晶(MeOH)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.83(1H，s，H-2′)，7.74(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.98(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.50(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.28(1H，s，H-6)，3.83(2H，s，H-6′′)，3.60～3.50(4H，m，H-2～5)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：177.7(C-4)，165.9(C-7)，162.9(C-9)，158.4(C-5)，149.1(C-4′)，148.4(C-3′)，146.6(C-2)，124.6(C-3)，124.4(C-1′)，122.1(C-6′)，116.4(C-5′)，116.3(C-2′)，104.9(C-10)，102.9(C-1′′)，99.5(C-6)，94.6(C-8)，75.2(C-3′′)，74.1(C-2′′)，71.2(C-4′′)，78.2(C-5′′)，62.8(C-6′′)。以上数据与文献[13]报道一致，故鉴定化合物6为槲皮素-3′-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物7无色针状结晶(MeOH)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.29(1H，dd，J=7.8，7.2 Hz，H-5)，7.06(1H，t，J=2.4 Hz，H-2)，6.83(1H，t，J=2.4 Hz，H-6)，6.76(1H，dd，J=7.8，2.4 Hz，H-4)，4.60(2H，s，-CH2)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：156.7(C-3)，142.6(C-1)，130.2(C-5)，118.3(C-6)，115.0(C-4)，114.1(C-2)，65.2(-CH2OH)。以上数据与文献[14]报道一致，故鉴定化合物7为3-羟基苯甲醇。

化合物8白色粉末(CHCl3)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.21(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.66(2H，d，J=7.8 Hz，H-3′，5′)，4.59(1H，dd，J=6.6，6.0 Hz，H-1)，3.70(2H，m，H-2)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：157.7(C-4′)，133.9(C-1′)，128.2(C-2′，6′)，116.0(C-3′，5′)，74.9(C-1)，68.4(C-2)。以上数据与文献[15]报道一致，故鉴定化合物8为1-(4-羟基苯基)乙烷-1，2-二醇。

化合物9无色油状(MeOH)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：6.98(1H，s，H-2)，6.79(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，6.62(1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，3.89(3H，s，H-10)，3.89～3.69(2H，m，H-8，9)，2.84(1H，m，H-7)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：147.9(C-3)，146.0(C-1，4)，120.2(C-6)，115.2(C-5)，112.0(C-2)，64.9(C-8，9)，56.2(C-10)，49.7(C-7)。以上数据与文献[16]报道一致，故鉴定化合物9为2-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-丙烷-1，3-二醇。

化合物10无色针晶(CHCl3)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.14(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.72(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，3.79(2H，t，J=7.2 Hz，H-8)，2.82(2H，t，J=7.2 Hz，H-7)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：157.0(C-4)，131.2(C-1)，131.1(C-2，6)，116.4(C-3，5)，64.9(C-8)，39.7(C-7)。以上数据与文献[17]报道一致，故鉴定化合物10为2-(4-羟基乙基)乙醇。

化合物11无色针晶(MeOH)；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.28(2H，s，H-2，6)，3.77(6H，s，3，5-OCH3)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：170.4(C-7)，149.0(C-3 ，5)，141.9(C-4)，122.3(C-1)，108.3(C-2，6)，56.8(3，5-OCH3)。以上数据与文献[18]报道一致，故鉴定化合物11为丁香酸。

DPPH 自由基清除实验结果(表1)显示，化合物1～11均有不同程度的自由基清除能力，且全部具有浓度依赖性。其中化合物1～6为黄酮类化合物，浓度为 200 μmol/L 时，自由基清除率均大于80%，且化合物1、2、3、5、6的IC50值与阳性对照维生素E相当(表1)，这主要由于结构中富含酚羟基而起到显著的DPPH清除作用，表现出较强的抗氧化活性。

表1 化合物1～11的DPPH自由基清除率Table 1 DPPH free radical clearance of compounds 1-11

4 讨论

本文对洋甘菊的化学成分进行了系统的分离和鉴定，从中得到了11个化合物，主要为黄酮和芳香类物质，其中1～3、5、7～11为首次从该植物中分离得到。这为阐明洋甘菊药效物质基础提供了一定的依据。

前期有文献报道洋甘菊具有抗炎、抗氧化、降血压和降血脂的作用，尤其是从中分离得到的黄酮类成分有显著活性[19，20]。本次研究洋甘菊的主要化学成分为黄酮和小分子酚酸，而且所发现的化合物均表现出一定程度的DPPH自由基清除活性，尤其是黄酮类物质1～3、5、6表现出与对照组相当的活性，推测洋甘菊可以改善治疗多种疾病可能与其含有的抗氧化成分有关，当然，这需要进一步的实验证实。