毛尖茶叶多糖的提取与活性测定研究

张莹莹

（山西师范大学临汾学院，山西临汾 041000）

茶作为一种有很悠久历史的饮品，目前已经研究出它可以降低血糖、减少血脂、清除抗氧化剂的自由基，增强免疫力和阻断活性等。罗祖有等还采取了其他措施证明了藤茶多糖进行抗氧化作用、减少自由基和提高免疫力，是研究和了解植物多糖药理活性的基础。许多研究表明，茶中的许多化学物质会产生自由基，包括抗氧化剂、多酚氨基酸链和多糖等，可以通过不同的方式研究茶多糖的抗氧化和自由基显像活性。而迄今为止，还没有关于复合多糖对多糖活性的贡献的研究。

1 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验仪器与材料

1.1 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验仪器

CARY50全波长紫外扫描仪，自动旋光仪WZZ-2S，Agilent 7890A-5975C气相色谱质谱仪，配备DB-5柱（30m×0.25mm，0.25mm）和质谱检测仪器，Agilent1200液相色谱仪，配备G1352ARID检测器，TSK5000G5000PWXL凝胶色谱柱（300mm×7.8mm），LAB-ORATA4000旋转蒸发仪，电子秤AR224CN，TD5A-WS高速度监控器，冷冻干燥机ZRQ30，WF2UV-2100紫外光谱仪。

1.2 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验材料与试剂

茶叶的毛尖样品存储在实验室样品库中（编号为20150822-1）。DMEM培养基，胎牛血清，一氧化氮（NE）测试试剂盒（硝酸还原酶法），1,1-二苯基-2-三硝基苯基肼，多糖分子量(分别为12000,25000,50000,80,000,270000,410000,670000Da，美国Aldrich公司）透析袋，葡萄糖，木糖，半乳糖，阿拉伯糖，甘露糖，氯化钠，氯仿，正丁醇和全乙醇等试剂。

2 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验方法

2.1 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验毛尖茶叶多糖的提取

将1250g毛尖茶叶用乙醇回流萃取两次。按照文献中的多糖提取方法处理残渣，通过Sevag方法除去残留物，直到扫描的波长280nm的地方没有清晰的吸收峰为止。重复用乙醇和丙酮的水溶液进行洗涤，以获得从毛尖茶叶的精制多糖。

2.2 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验毛尖茶叶多糖的分离纯化

将12.74g从毛尖茶叶中提取的多糖溶解在蒸馏水中，并通过DEAEDE-52离子交换色谱法进行分离，并从蒸馏水和0.2、0.4、0.6升/lNaCl溶液洗脱，从每一批收集5.0L。将洗脱的部分浓缩，置于透析袋中进行透析、分离并纯化，然后以水为流动相进行洗脱。用收集器收集洗脱的部分，每个收集管大约收集3ml，将通过高效液相色谱法检测到的相似峰合并，得到对称的毛尖茶叶多糖组分，将其称为MTP。

2.3 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验MTP的特性分析

2.3.1 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验旋光度测定

把10.0mgMTP放置在25ml的容量瓶中，以水溶解，配制0.4g/l的多糖溶液。将20ml溶液加入到旋光管中，作为空白对照组，通过自动旋光仪测量MTP的光学强度。

2.3.2 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验分子量分布的测定

通过HPLC测定多糖的一般溶液和一系列MTP溶液。色谱柱为TSK G5000PWXL（300mm×7.8mm）凝胶色谱柱。柱温为40°C，流动相在0.002mol/l磷酸氢钠（含0.05%NaN3）下的流速为0.8ml/min，RID检测器检测。加入适量的分子量为12000、25000、50000、80000、270000、410000和670000Da的葡聚糖标准溶液，加入去离子水，配制成2g/l的溶液，并进行过滤。同时进行HPLC分析，用保留时间（RT）作为横坐标x，用分子量的log10的值作为纵坐标y，得到y=-0.332x+10.224（r=0.9980）。称量一定量的MTP并添加去离子水，再按照上述步骤制备质量浓度为2g/l的样品溶液，并根据上面的标准曲线公式计算。

2.3.3 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验单糖组成的测定

根据文献中描述的方法，对MTP进行完全水解，以减少乙酰基衍生化，并且使用标准单糖作为参考来测量MTP的单糖组成。气相条件为DB-5色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）。该检测器输入温度为250°C，检测器的温度为280℃，氮气流速为0.6ML/min，分流比例为20：1，进样量为5μL，程序温度在200℃，2分钟，温度升至约2℃至245℃，然后以10°C/分钟的速度升高至270°C，持续2分钟。

2.4 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验MTP对小鼠巨噬细胞增殖的影响

根据文献中描述的方法，在96孔板中测量了MTP对小鼠巨噬细胞增值能力的影响。第1组为对照组，第2-7组为药物组。药物治疗组的多糖溶液的最终浓度为30,90,150,300,500,800mg/l，对照接受终浓度为10mg/L。施用药物后，将细胞在5%CO2，37℃的培养箱中培养24小时，吸去培养液，并在每个孔中加入20μmLMTT，并在上述条件下培育4小时。弃去上清液，加入150μlDMSO混合并进行振荡。在酶标仪570nm波长下测量吸光度，对照组的吸光度为100%，并为每个监测组计算细胞的相对生长速率。

2.5 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验MTP对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响

根据文献中描述的方法，将中性红用作对象，并在96孔板中测量MTP对RAW264.7小鼠噬菌体吞噬作用的影响，分组管理等效于2.5。施用药物后，在5%CO2,37°C的培养箱中培养24小时，加入浓度为720mg/L的100mg中性红色溶液。再将细胞在5%CO2,37°C的培养箱中放置24小时。搅拌培养物，将50μl冰醋酸和50μl乙醇充分混合，并在4°C下在冰箱中保存2小时。将96孔板从冰箱中取出，并振荡10分钟以找到包括酶标仪在495nm波长的吸光度。对照组的吸光度为100%，并分别根据两组的摄取率计算细胞增值的比率。

3 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验结果

3.1 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验MTP的旋光度及分子量

经过计算得出，MTP旋光度为20D=+42.0°。MTP的HPLC色谱图如图1，根据标准曲线计算出5.5×105Da的重均分子量。

3.2 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验MTP的单糖组成

测量得出，MTP由阿拉伯糖精、木糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为2.44：1：1：1.54：1.28。

3.3 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验MTP的清除DPPH自由基活性

MTP对0.1 mmol/LDPPH自由基清除的浓度为38.26%（RSD=2.28%）。

3.4 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验MTP对小鼠巨噬细胞增殖的影响

图2显示了在不同质量浓度条件下吸收值的比值。可以看出，不同浓度的MTP溶液对细胞增殖有多种作用。在30-500mg/L范围内，给药物组与对照组之间存在显著差异。在500mg/L的高浓度下，扩散效果逐渐增强并达到最大值。

图1 MTP的高效液相色谱图

图2 MTP对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖的影响

3.5 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验MTP对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响

图3结果显示了在不同质量浓度条件下每个孔中的吸收值之比。在图3中，可以看出不同浓度的MTP溶液对细胞的吞噬作用具有不同的作用。在30-500mg/L范围内施用多糖组和对照组之间存在显著差异。吞噬细胞活性的发生率逐渐增加，并在500mg/L的浓度下达到峰值。

3.6 毛尖茶叶多糖的提取与活性测定实验MTP对小鼠巨噬细胞产生NO的影响

图4显示了在不同质量浓度条件下产生NO的量。图4表明，不同浓度的MTP溶液对细胞中NO产生的影响不同。在300-800mg/L的范围内，NO产生对细胞的影响显著不同，在500mg/ml达到最大值。

4 讨论与结论

图3 MTP对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬能力的影响

图4 MTP对小鼠巨噬细胞RAW264.7产生NO能力的影响

在本文中，主要研究了从毛尖茶中分离纯化出单糖多糖成分MTP，以评估单糖的组成和分子量分布，其特征主要在于多糖结构。此外，本文通过多种提供药理活性的方法来论述MTP的药理活性，这些方法为多糖和其他毛尖茶叶多糖的开发和使用提供了实验基础。药理实验的结果表明，MTP具有消除DPPH自由基的特定能力。DPPH自由基可能是毛尖茶叶的有效活性来源之一，该结果与作者先前的研究结果一致，进一步表明了多糖颗粒的自由基清除活性。体外药理模型在Raw264.7细胞活性测试中研究了不同MTP质量浓度对小鼠巨噬细胞不同生理序列的影响，在30-500mg/l的药物输送范围内，随着给药浓度的增加促进了小鼠吞噬细胞的增殖，增加了细胞吞噬作用和NO的产生，并证明了毛尖茶叶可以显示多糖的免疫刺激作用，为进一步研究多糖提供了实验环境。MTP对其他模型的影响对于进一步的研究和分析是有价值的，从而可以使用更多的实验数据，实验结果更准确，可以正确地分析毛尖茶叶多糖。此外，当MTP的质量浓度很高时，药物活性实验的指标反应会减少，并且大剂量MTP对介导细胞的作用会引起细胞代谢或细胞毒性。低剂量的MTP生产活性和高剂量的线性趋势表明，MTP对RAW264.7细胞具有明确的靶点或通路，尚需要进一步研究。本研究为毛尖茶叶的合理开发和利用提供了理论依据。