HPLC测定不同地区桑椹饮片中七种成分含量△

常艳旭，王涛，李晋，何俊，金华，马琳，杨雪晶，3*

1.天津中医药大学/天津市现代中药重点实验室，天津 300193；2.天津中医药大学 中药学院，天津 300193；3.哈尔滨商业大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150076

桑椹为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥果穗。现代研究表明，桑椹具有抗氧化、延缓衰老、抗疲劳、增强免疫力、降血脂、降血糖等药理作用[1]。生物碱、黄酮类和有机酸为桑椹的主要化学成分，如芦丁有祛脂的效果、具有抗氧化能力[2]，绿原酸具有抑菌、抗炎、调节脂质代谢等功效[3-4]。

2015版《中华人民共和国药典》尚未规定桑椹的含量测定项中指标成分，仅对其浸出物、水分、总灰分进行检查[5]。本研究选择了桑椹饮片中7种成分(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷和槲皮素)为指标性成分，采用高效液相色谱法(HPLC)，建立桑椹饮片中7种成分同时测定方法，并对国内不同地区、不同批次的桑椹饮片进行测定，拟为桑椹饮片质量控制指标选择和质量评价提供参考，为桑椹药用价值进一步开发利用提供质量评价手段。

1 材料与方法

1.1 仪器

粉碎机(吉首市中诚制药机械厂)；离心机(Sigma)；天平(德国Sartorius公司，BP121S)；Mill-QⅡ型超纯水器(Millipore公司)；XW-80A涡旋混合器(上海沪西分析仪器厂)；SHB-111循环水式多用真空泵(西安太康生物科技有限公司)；Agilent 1260型高效液相色谱仪；SB-1000YDTD超声清洗槽(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试药

紫云英苷对照品(批号：MUST-13092001)、绿原酸对照品(批号：MUST-14091701)、隐绿原酸对照品(批号：MUST-13013002)、芦丁对照品(批号：MUST-11040302)、槲皮素对照品(批号：MUST-13072505)、异槲皮苷对照品(批号：A0439)和新绿原酸对照品(批号：12031401)均购自成都曼思特生物科技有限公司，其纯度均>98%。

桑椹饮片购自国内不同省市的药店，经天津中医药大学马琳教授鉴定为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥果穗，样品保存于天津中医药大学中医药研究院。桑椹样品粉碎，过60目筛，备用。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 江苏汉邦科技有限公司ODS-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以水(含0.2%甲酸)为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱程序为0～36 min，7.6%～7.6%B；40～45 min，12%～13%B；55～70 min，17%～28%B；72～74 min，31%～32%B；76～96 min，38.2%～7.6%B；平衡时间为5 min；柱温为35 ℃；流速为1 mL·min-1；进样量为15 μL；吸收波长360 nm。

1.3.2 样品的制备 精密称取桑椹粉末0.5 g，置于10 mL具塞锥形瓶中，加入80%甲醇10 mL，称质量，超声提取40 min，静置放冷，补足质量，14 000 r·min-1离心10 min后，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，即为样品溶液。

1.3.3 标准曲线及线性范围 将对照品储备液配制成含有新绿原酸(250 μg·mL-1)、绿原酸(1.4 mg·mL-1)、隐绿原酸(1 mg·mL-1)、芦丁(800 μg·mL-1)、异槲皮苷(150 μg·mL-1)、紫云英苷(100 μg·mL-1)、槲皮素(100 μg·mL-1)的混合对照品储备液。精密移取该混合对照品储备液，用甲醇稀释成一系列浓度，记录各浓度下的峰面积，并制作标准曲线。

1.3.4 精密度、稳定性、重复性试验 精密度分为日间精密度和日内精密度。日内精密度为同一份样品溶液在1 d内连续进样6次，日间精密度为连续3 d内每天连续进样6次。稳定性试验为一份样品溶液分别在0、2、4、6、8、12、24 h内进样。重复性试验为平行制备6份桑椹样品溶液，连续进样。

1.3.5 加样回收率 精密称定已知含量的桑椹药材粉末0.250 g(平行操作6份)，分别按所含7种成分量的50%加入对照品，按照样品处理方法进行处理，测定加样后7种成分的含量，计算加样回收率。

2 结果

2.1 高效液相色谱法方法学验证

2.1.1 标准曲线的绘制 以对照品质量浓度为横坐标(μg·mL-1)，峰面积为纵坐标制作标准曲线，并得出回归方程、相关系数(见表1)。分别以信噪比(S∶N)3∶1和10∶1作为检测限(LOD)和最低定量限(LOQ)。从表1中可以得知，7个化合物在线性范围内相关系数均大于0.998 0，表明7个化合物在各自的线性范围内线性关系良好。

表1 7种成分标准曲线、线性范围、LOD和LOQ

2.1.2 精密度、稳定性、重复性试验 桑椹中各成分的精密度、重复性和稳定性结果见表2。结果发现7种成分日内、日间精密度RSD<4.9%，表明该方法精密度良好；重复性RSD<2.4%，表明该方法重复性良好；稳定性RSD<3.0%，表明该方法稳定性良好。

表2 7种成分精密度、重复性、稳定性和回收率结果 %

2.1.3 加样回收率 由表2结果可知，7种成分的平均回收率均在95.0%～105%，且RSD<4.4%，表明该方法对桑椹中7种成分的含量测定的准确度较高。

2.2 桑椹饮片中7种化学成分含量

桑椹饮片样品中7种成分以及对照品溶液的色谱图见图1。由表3可知，桑葚饮片中各成分质量分数：新绿原酸10.96～478.82 μg·g-1；绿原酸5.82～2 619.6 μg·g-1；隐绿原酸9.56～1 657.58 μg·g-1；芦丁26.8～1 307.58 μg·g-1；异槲皮苷7.78～253.48 μg·g-1；紫云英苷8.02～62.72 μg·g-1；槲皮素11.04～68.64 μg·g-1。

注：A.混合对照品溶液；B.桑椹饮片样品溶液；1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；4.芦丁；5.异槲皮苷；6.紫云英苷；7.槲皮素。图1 混合对照品和桑椹饮片的HPLC图

表3 不同地区的桑椹饮片7种化合物含量测定结果(n=3) μg·g-1

注：—为对应化合物的含量在检测限下或该批次饮片中不含有该种成分。

3 讨论

3.1 流动相选择

在选择流动相过程中，因为桑椹中化合物的极性范围分布较广，且化合物种类繁多，在色谱分离时不易得到理想的峰形，参考相关文献[6]，考察了0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈、0.1%磷酸水-乙腈、0.1%磷酸水-甲醇、0.1%磷酸水-甲醇乙腈(1∶1∶1)和0.2%甲酸水-乙腈等流动相组成，发现水相为磷酸水的效果要优于甲酸水，峰形较好，且分离度良好，同时整体的色谱分离检测时间稍短。有机相乙腈的效果好于甲醇-乙腈(1∶1)、甲醇，其中加了甲酸的乙腈的色谱图基线较不加甲酸的更加平稳，但无明显影响，因此选择了0.2%甲酸水-乙腈为流动相。

3.2 提取条件的选择

采用饮片粉碎后用超声波提取，该方法具有简便、安全、有效等特点。在单因素提取条件下，以提取效果为指标，提取时间结果为：40 min>20 min>30 min>10 min；溶剂浓度：60%>80%>100%>40%；料液比：1∶20>1∶15>1∶10>1∶5。运用正交优化试验法，选取甲醇浓度、提取时间、料液比3个因素，每个因素为3水平，以桑椹中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷和槲皮素7种成分的总含量为指标，选用L9(34)正交设计，对桑椹中7种成分最佳超声提取条件的优化，发现甲醇浓度是最关键的影响因素，其次为料液比和提取时间；确定最佳提取条件为0.50 g桑椹粉末采用10 mL 80%甲醇溶液超声提取40 min。

4 结论

本研究建立了一种稳定、可靠的桑椹中7种黄酮类成分(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷和槲皮素)含量同时测定的高效液相色谱(HPLC)方法，经方法学验证，符合分析要求，并对不同地区、不同批次的桑椹饮片中7种成分的含量进行测定，结果表明，芦丁为平均含量最高成分，而异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素平均含量较低，国内不同地区所用桑椹饮片质量存在较大差异，需要对其生产产地、加工方法、质量评价指标进行深入研究，确保其临床有效性。