广豆根无菌播种产业化繁育技术研究△

李林轩，梁莹，秦双双，缪剑华，韦坤华

广西药用植物园/广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，广西 南宁 530023

广豆根，又称山豆根、南豆根，为豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根及根茎，是著名的广西道地药材和常用中药，为《中华人民共和国药典》2015版所收载[1]。主要分布在广西、云南，贵州亦有产，但产量较小[2]。广豆根药材味苦，寒，有毒，具有清热解毒、消肿止痛等功效，可以治疗喉痈、喉风、喉痹、牙龈肿痛、喘满热咳、肝炎、便秘、黄疸、下痢、痔疾、秃疮、疥癣及蚊、虫、犬咬伤等[3-4]。由于使用量的增加及药材使用与种植模式的改变，广豆根野生资源急剧下降，在某些区域几乎已经绝迹，很难满足市场需求[5]。在野生资源的压力下，在过去的10年里，广豆根的药材价格增长了10倍左右，现在已经达到了210元/kg。在自然条件下，广豆根主要依靠种子进行繁育，但在开花结荚期广豆根的病虫害严重，且种子成熟时自然脱落的特性常造成种子产量低，生产上难以实现大面积栽培[6]。

随植物组织培养技术的迅猛发展，许多濒危植物已经在组织培养工厂化生产上取得了成功[7]，对广豆根进行组织培养工厂化生产是最为快速获得广豆根种苗的途径，不仅可以解决市场需求不足的问题，对保护国家生态环境及药用资源都具有深远的意义。本研究通过无菌播种获取大量的基础生产材料，并通过丛生芽快速繁殖建立广豆根种苗的繁育体系，并应用于组织培养工厂化生产中，可以大大缩短生产周期，减低生产成本，提高种苗质量，从而提高种苗成活率及药材产量。

1 材料与方法

1.1 材料

广豆根野生植株引自靖西、那坡等地，种植于广西药用植物园广豆根种植基地，取其优良株系的果荚进行实验及生产。

1.2 方法

1.2.1 培养基及培养条件 以MS或1/2MS为基本培养基，植物生长调节剂选用6-BA、KT、NAA、IAA、IBA，根据实验目的和材料的生长情况添加不同的外源添加物(活性炭)，并附20 g·L-1蔗糖、0.5 g·L-1的活性炭(AC)及4.0 g·L-1的琼脂粉，pH值为5.8。培养基配置分装后于121 ℃、压力为105 Pa的条件下灭菌15 min。冷却后接入植物材料，在温度(25±3)℃，光照时间12 h·d-1的条件下培养。

1.2.2 种子的灭菌消毒 采摘结荚后生长90～180 d的尚未开裂的果荚，用自来水洗去表面灰尘，并用刀片轻轻刮去表面的脏物，然后移至超净工作台内进行无菌操作，先放入75%乙醇中浸泡2 min后，转入0.1% HgCl2溶液中消毒10 min，期间不断摇动，无菌水漂洗3遍，用无菌滤纸吸干材料表面水分后将果荚剖开，将里面的种子取出接种于培养基的表面。

1.2.3 种子成熟度对其萌发的影响 选取结荚后生长90、120、150、180 d尚未开裂的广豆根果荚，灭菌消毒后转接到MS培养基上，培养30 d后分别观察种子的萌发情况并记录。

1.2.4 丛生芽的繁殖复壮一体化培养 以MS+0.2 mg·L-1AC为基本培养基，添加不同的激素组合(6-BA 0.5～2.0 mg·L-1、KT 0～0.5 mg·L-1)及单切接入由种子萌发后的胚，在不同时间放入不同的光照强度(日光灯光照强度2000～4000 Lux)下培养。30 d后，观测丛生芽生长的情况，筛选出丛生芽繁殖复壮一体化培养的最佳培养基配方。

1.2.5 生根炼苗同步化培养 将经过壮苗培养的健壮丛芽分离成单芽，转移到不同的生根培养基中培养，实验中选定1/2MS+0.2 mg·L-1AC为基本培养基，附加不同质量浓度的NAA(0～1.5 mg·L-1)，生根培养30 d后统计生根率[(生根苗数/外植体数)×100%]和平均根数(根数/生根苗数)等指标，综合苗的生长情况，确定最佳生根培养基。

1.2.6 苦参碱及氧化苦参碱含量测定 参照《中华人民共和国药典》(2015)方法对广豆根组培苗不同时期(0个月、移栽3个月、移栽6个月)的根部药材进行含量检测，考察其有效成分含量。

2 结果与分析

2.1 种子的萌发培养

广豆根种子经消毒灭菌后播种到诱导萌发的MS培养基上进行培养，比较发现，不同成熟度种子的萌发情况不同，见表1。结荚后生长90～120 d的种子，萌发需时较长(60 d以上)，生长缓慢，萌发率仅为42.5%，繁殖率低，大部分种子出现变黑、死亡的情况；结荚后120～150 d的种子，萌发时间短(25～40 d)，生长较快，萌发率82.8%，少量种子变黑并死亡；结荚150～180 d的种子，萌发时间最短(15 d左右)，30 d萌发率高达95.7%，且长出的芽健壮。因此，广豆根无菌播种应采用结荚后生长150～180 d未开裂的果荚为佳。

表1 不同成熟度种子的萌发情况

2.2 丛生芽的繁殖复壮一体化培养

将种子萌发获得的丛生芽，单切转接到不同的光照和不同配方的培养基中进行继代增殖培养，结果表明，不同光照和不同激素组合对广豆根的丛生芽继代增殖和生长情况有较大的影响。从表2可以看出，丛生芽增殖主要受6-BA影响，当激素组合为6-BA1.5 mg·L-1+IAA0.3 mg·L-1+KT0.3 mg·L-1、光照为2000 lux 15 d和4000 lux 15 d时，增殖速度快，增殖多，芽苗健壮，色较绿，展叶较好，见图1，增殖倍数约7倍/30 d。当激素浓度6-BA>1.5 mg·L-1、KT>0.3 mg·L-1时，丛生芽增殖速度快，但丛生芽逐渐出现玻璃化现象，不利于下一步生根。

图1 广豆根丛生芽

2.3 生根炼苗同步化培养

将繁殖复壮一体化培养获得的叶片展开、木质化程度较高的健壮芽苗剪下，接种到生根培养基中进行生根炼苗同步培养，不同培养组合对广豆根组培苗的生根和生长情况有较大的影响。从表3可以看出，丛生芽生根受NAA影响最大，当NAA质量浓度在0.5～1.0 mg·L-1时广豆根组培苗生根率及平均生根数随浓度的升高而提高，当NAA质量浓度>1.5 mg·L-1时，反而对广豆根丛生芽生根产生抑制作用，添加少量IBA对广豆根丛生芽生根有一定的促进作用，但质量浓度>0.5 mg·L-1时则产生了副作用，使芽苗生长偏细。因此，当激素组合为NAA1.0 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1生根效果最好，综合生产能耗及污染情况考虑，在培养室培养20 d移植炼苗大棚培养炼苗效果最好，广豆根组培苗生根率高，根数多，生长良好，污染极少，见图2。

表2 不同组合对广豆根丛生芽繁殖的影响

表3 不同组合对广豆根丛生芽生根炼苗的影响

注：a.培养室内生根苗；b.炼苗棚内生根苗。

图2 广豆根试管苗

2.4 驯化移栽

通过生根炼苗同步化培养，广豆根试管苗已经在大棚内形成完整的植株，可直接将生根苗的瓶盖打开，取出生根苗，洗净根部残留培养基(见图3a)，移栽至泥炭土、碳化稻谷壳和珍珠岩的质量比例为4∶4.5∶1.5混合后的基质最佳。育苗要求相对湿度为75%～90%，温度20～25 ℃，遮光度60%～75%，30 d后成活率能达到95%(见图3b)。

注：a.清洗干净的试管苗；b.移栽基质的试管苗。图3 广豆根试管苗移栽

2.5 苦参碱及氧化苦参碱的含量检测

采用高效液相色谱法(2015年版《中华人民共和国药典》)对广豆根组培苗不同时期(0个月、移栽3个月、移栽6个月)的根进行了含量测定，检测结果见表4。

表4 不同时期广豆根含量 %

注：St0广豆根组培苗；St3组培苗大棚移栽生长3个月，t6移栽生长6个月。

通过含量检测发现：在组培苗阶段，广豆根就含有少量的苦参碱和氧化苦参碱；随着生长周期的延长，含量逐步升高，移栽3个月、6个月的广豆根组培苗的有效成分含量均符合《中华人民共和国药典》要求，与组培苗St0个月相比，移栽后3个月、6个月的广豆根组培苗总生物碱、苦参碱和氧化苦参碱分别提高3.9倍、4.14倍。因此广豆根组培苗适合作为药材种苗进行推广种植。

3 讨论与结论

在植物组织培养工厂化生产中无菌材料的快速获取至关重要，此项工作的成败直接决定了整个生产成功与否。广豆根无性繁殖所用的外植体主要有种子和茎段，但以种子效果最好[8-11]。实验主要通过考察结荚后生长不同时间的广豆根种子作为外植体灭菌后的萌发情况，广豆根结荚后生长90～180 d以内的种子，均能作为外植体萌发。结荚150～180 d的种子，萌发时间最短(15 d左右)，30 d萌发率高达95.7%，且长出的芽健壮。因此，广豆根无菌播种应采用结荚后生长150～180 d未开裂的果荚为佳。

培养基中外源激素的种类与浓度对植物组织培养非常关键。在本研究中，我们使用6-BA、IAA、KT以及光照进行繁殖筛选，NAA和IBA进行生根筛选。6-BA是在植物组织培养领域一种重要的激素，可以促进植物细胞分裂、侧芽生长等[12]。KT是第一个植物激动素，也具有促进细胞分裂的作用[13-14]IAA在植物的生长与发育上起着非常关键的作用，可以通过调节或影响植物的多种反应来发挥作用[15]。在研究中笔者发现，如果细胞分裂素的质量浓度超过2.0 mg·L-1，芽的增殖就会出现异常，如玻璃化等。如果IAA质量浓度低于0.3 mg·L-1，叶片又不能展开，过高又使芽苗纤细，同时激动素KT浓度也不易过高，过高会加剧丛生芽玻璃化，所以确定最佳的增殖培养基为MS+1.5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA 和0.3 mg·L-1KT。

植物的生长受到光合作用影响[16]。在研究中发现，培养室中合适时间内提高光照强度促使丛生芽展叶，这就意味植物叶表面积越大，能够获得的光合作用越强[17]，从而为生长提供更多的物质与能量；所获得的结果就是在丛生芽繁殖阶段能使丛生芽其木质化程度提高，展叶良好，利于下一步生根。同时，通过生根炼苗同步化培养能有效地提升生产空间并节约炼苗时间，促使试管苗更好适应移植环境，加大了移栽后的质量及成活率。

总之，通过组织培养技术，建立了一种快速、有效、便捷的广豆根种苗繁育方法。在对广豆根组培苗进行综合的质量评价后，笔者发现山豆根组培苗的质量符合《中华人民共和国药典》2015版的质量要求，由组培苗生产的广豆根药材可以替代种子苗药材使用。