大鼠胸腺内注射MBP诱导免疫耐受对手术SBI引起的脑神经功能缺陷和脑水肿作用研究

姚 斌，洪晓雅2*，尚福泰2，惠亮亮，安旭生

(南京医科大学附属淮安第一医院 1.重症医学科,2.麻醉科,江苏 淮安 223300)

手术脑受损(SBI)是指在实施神经外科手术过程中导致非疾病本身引成的神经系统免疫反应[1]。人们的正常机体内存在一些微量的抗脑抗体，但是当SBI破坏血脑屏障时，会释放出大量的脑抗原进入血液，刺激机体产生大量的脑抗体，激活免疫系统引起继发反应导致脑水肿、血脑屏障破坏及神经元死亡，进一步加重脑损伤[2]。目前临床上治疗继发性炎症反应比较新颖的方式是针对抗原特异性的诱导免疫耐受治疗方法[3]。胸腺是一个对于T淋巴细胞非常重要的场所。T淋巴细胞在其经历分化、发育和成熟阶段，它可以经过阴性选择获得自身免疫耐受特性，而胸腺表达的内源性蛋白质也会经过抗原提呈细胞提呈给淋巴细胞，诱导中枢免疫耐受[4]。髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)是在中枢神经系统中仅次于蛋白脂蛋白之后含量第二丰富的蛋白质，但是在胸腺中并不表达[5]。所以本文拟在大鼠胸腺内注射MBP诱导免疫耐受，观察其能否减轻SBI引起的脑神经功能缺陷和脑水肿。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SD大鼠30只，体重260～300 g，雌雄各半，购自苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司，许可证号：SDK(苏)2009-0001；饲养室温22～25 ℃，湿度35%～50%，自由摄食及饮水，适应性喂养1周后进行试验，随机分为假手术组、模型组和MBP处理组，每组10只。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠SBI模型制备 经腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉后备皮，安装立体定向仪，头部消毒。无菌条件下，正中矢状位切开头皮，暴露颅骨，于矢状缝右侧2 mm、冠状缝后1 mm处开直径4 mm骨窗，尖刀切开硬脑膜后锐性切除大小2 mm×3 mm ×3 mm脑组织，止血后逐层缝合，随后，大鼠取仰卧位，无菌条件下沿颈部正中切开皮肤和皮下组织，仔细分离肌肉，沿胸部正中剪开胸骨柄，暴露胸腺。在直视下，模型组和MBP处理组分别每侧胸腺注射50 μL等渗盐水和MBP(1 mg/mL)。止血后逐层缝合皮下组织和皮肤[6]。

假手术组：照同样方法开骨窗，但保持硬脑膜完整，暴露胸腺只进行空针穿刺，未注射任何物质。

1.2.2 大鼠神经系统行为评价 造模后的1天、7天和14天,对大鼠进行神经系统行为评价(MNSS)，评分包括5个方面：提尾反射(0～3分)、行走测试(0～3分)、感觉测试(0～2分)、平衡测试(0～6分)、反射缺失和反常运动(0～4分)，大鼠缺失1项反射或不能完成测试即计相应分数，分数越高，损伤越重。

1.2.3 大鼠脑水肿体积检测 造模后的1、7和14天，对大鼠行头部MRI扫描，并利用交互式分割算法分割每个断面，获得每个断层图像的边缘，计算每个截面的面积并乘以该断层厚度即可获得水肿部分体积。

1.2.4 血清炎性因子检测 造模术后1、3、7、14、21天心脏穿刺取血800 μL，分离血清-80 ℃保存，ELISA法检测IL-1、IL-2和TGF-β浓度。

1.2.5 PCR检测 (1)组织总RNA提取：用TRIzol试剂盒提取匀浆后的脑组织的RNA(按照说明步骤进行)，然后用紫外分光光度计进行定量，并保存在-70℃冰箱备用；(2)逆转录合成cDNA：以Oligo(dT)18为引物，反应体积2 μL，补DEPC处理的水至终体积25 μL，按说明操作。-20 ℃冻存；(3)PCR扩增，上游引物为5′-GGAATGGGAAGACACATATGGAACTGC-3′，下游引物5′-CATATCTGGCCAGTAGTGCAGTAATTC-3′，25 u12xSYBR GREEN MIX和cDNA2 μL，200 μmol上下游引物,补ddH20至50 μL，然后以50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min的反应条件，进行50个循环(95 ℃ 15 s，退火温度30 s，72 ℃ 30 s)进行PCR扩增。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠MNSS评分比较

三组随时间延长，MNSS评分有所降低；模型组和MBP处理组处理后7d、14d MNSS评分明显高于假手术组，其中MBP处理组处理后7天、14天 MNSS评分明显低于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠MNSS评分比较

与假手术组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05(n=10).

2.2 各组大鼠脑水肿体积比较

模型组和MBP处理组处理后7天脑水肿体积达到高峰；模型组和MBP处理组处理后1、7、14天脑水肿体积明显高于假手术组，其中MBP处理组处理后1、7、14天脑水肿体积明显低于模型组。见表2。

2.3 各组血清IL-1、IL-2和TGF-β水平

模型组和MBP处理组随时间延长，IL-1、IL-2和TGF-β水平有所降低；模型组和MBP处理组处理后1、7、14天，IL-1、IL-2和TGF-β水平明显高于假手术组，其中MBP处理组处理后1、7、14天，IL-1、IL-2和TGF-β水平明显低于模型组。见表3～5。

表2 各组大鼠脑水肿体积比较 (mm2)

与假手术组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05.

表3 各组血清IL-1水平比较 (pg/mL)

与假手术组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05(n=10).

表4 血清TGF-β水平 (pg/mL)

与假手术组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05(n=10).

表5 血清IL-2水平 (pg/mL)

与假手术组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05(n=10).

2.4 各组脑组织FasL mRNA表达

MBP处理组脑组织FasL mRNA相对表达量为(0.876±0.112)，明显高于假手术组和模型组。见表6。

表6 各组脑组织FasL mRNA表达

与假手术组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05(n=10).

3 讨 论

开颅手术一般都会有较大的创口，由此会导致免疫细胞攻击一些暴露出的具有免疫耐受的神经组织，继而激活小胶质细胞，并释放一些炎性因子[7]。此外脑组织中的部分蛋白和血液中的淋巴细胞会由于血脑屏障的破坏而互相交换地方，调节性T细胞在抗原与免疫细胞的接触诱导下会向TH1细胞转化[8]。巨噬细胞会被炎症因子诱导游动到损伤组织周围释放炎症因子，进一步造成机体发生炎症反应，产生免疫应答，加重脑损伤。MBP是一种强碱性膜蛋白，由脊椎动物神经系统(CNS和PNS)的细胞合成的[9]。当中枢神经系统受到损害，血脑屏障遭到破坏时，血清中的MBP含量就会明显增高，有研究[10]证明，MBP可以诱导机体产生自身免疫疾病，还能自主免疫保护中枢神经系统，所以MBP能减轻脑损伤带来的危害。

MNSS评分是评价神经功能的重要方式，其分数越高，说明神经功能损害越严重，实验通过对各组大鼠进行MNSS评分，我们发现随着时间的延长，各组的MNSS评分都明显的下降，且三组MNSS评分由高到低依次为模型组、MBP处理组和假手术组，说明三组大鼠都有一定的神经缺陷，但是对于脑损伤的大鼠来说，注射MBP可以改善神经缺陷。MRI检测脑水肿体积可以反映SBI后神经系统损伤程度及恢复程度，由实验结果我们可以看出，模型组和MBP处理组处理后7天脑水肿体积达到高峰，且三组脑水肿的程度由高到低依次是模型组、MBP处理组和假手术组，也进一步说明了MBP具有降低神经损伤、利于恢复的作用[11]。IL-1是一种细胞因子，是当机体发生感染时由单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞等细胞产生的，集落刺激因子、血小板生长因子等细胞因子可以在IL-1的刺激下分泌增加，参与免疫应答和组织修复[12]。IL-2主要是由活化的T细胞产生的一种重要的促炎因子，它可以趋化CD4+T细胞和CD8+T细胞到达损伤部位建立器官特异性的免疫反应。TGF-β即转化生长因子，它属于调节细胞生长和分化的TGF-β超家族，对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用，可以在同种异体移植耐受或自身免疫耐受中起到作用[13]。本实验结果显示，随时间延长，MBP处理组较模型组IL-1、IL-2和TGF-β水平有所降低，说明向胸腺注射MBI可以减轻炎症反应。介导哺乳动物细胞调亡的途径有多种，而Fas/Fasl的相互作用介导途径就是其中之一[14]。它在胸腺选择、免疫豁免等许多重要的生理过程发挥着重要的作用。其主要在CD4+CD8+早期阶段介导细胞凋亡，经过阴性选择后的胸腺细胞可以清除自身反应性细胞来获得中枢免疫耐受，并经自分泌方式诱导T细胞自身凋亡维持外周细胞免疫耐受。实验结果显示MBP处理组的FaslmRNA明显的高于模型组和假手术组，说明胸腺注射MBP可以术后Fasl的表达，促进T细胞的凋亡，诱导免疫耐受[15]。

综上所述，大鼠胸腺内注射MBP诱导免疫耐受可以减轻SBI引起的脑神经功能缺陷和脑水肿，并且降低炎症反应发生的概率。