CKMT1A对人鼻咽癌HONE1细胞铂类化疗药物敏感性的影响及机制研究

(文昌市人民医院耳鼻咽喉科，海南 文昌 571300)

鼻咽癌发病率位居耳鼻喉恶性肿瘤首位，多发于东南亚，我国广东、湖南等省份为高发地区[1]。放疗是目前临床治疗鼻咽癌的首选方案，对部分病情严重者常联用化疗[2]。随着近年来肿瘤治疗水平的不断提升，鼻咽癌患者五年生存率也超过了80%，但继续上升的难度增加，其中对铂类化疗药物的敏感性较差是其中一个主要原因[3]。线粒体肌酸激酶1A(Recombinant Creatine Kinase,Mitochondrial 1A ，CKMT1A)是存在于线粒体膜表面，与细胞内能量传递、ATP再生直接相关的重要激酶，广泛存在于胃癌、结直肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤[4]，但在不同类型肿瘤中的作用存在差异。相关研究显示，CKMT1A高表达与胃癌、结直肠癌的恶性程度呈正相关[5]；但与乳腺癌的恶性程度呈负相关[6]。目前关于CKMT1A在鼻咽癌中的作用仍鲜有报道。顺铂是鼻咽癌患者最常用的铂类化疗药物之一。人鼻咽癌细胞株HONE1能够敏感地反应出在人体中鼻咽癌细胞的生物学特性，被广泛用于鼻咽癌相关的体外研究[7-8]。通过前期预实验发现，低浓度顺铂作用人鼻咽癌细胞株HONE1可上调CKMT1A mRNA表达，但高浓度顺铂则发挥相反作用[9]。因此，可推测CKMT1A表达水平可能与鼻咽癌铂类化疗药物敏感性有关。本研究通过细胞转染技术对人鼻咽癌细胞行CKMT1A过表达，探讨对顺铂敏感性的变化，旨在为提升鼻咽癌铂类化疗药物化疗敏感性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人鼻咽癌细胞株HONE1购于上海博麦德生物技术有限公司。DMEM培养基、胎牛血清购于杭州仟诺生物科技有限公司。空载体质粒pCMV-Neo-Bam、CKMT1A过表达载体质粒购于上海百研生物科技有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒购于上海雅吉生物科技有限公司；小鼠抗人CKMT1A、c-PARP、BCL2、STAT3、p-STAT3单克隆抗体，兔抗人Bax单克隆抗体购于上海北诺生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染 使用DMEM完全培养基常规培养HONE1细胞密度为70%～80%时，更换成无血清的DMEM培养基，在6孔板中进行转染，具体为：分别将空载体质粒(空载体对照组)、CKMT1A过表达载体质粒(CKMT1A过表达组)加入含200 μL HEPES缓冲盐溶液的EP管中，再加入150 μL PEI混合均匀，室温静置20 min，将混合液加入HONE1细胞中进行转染，常规培养6 h后更换DMEM完全培养基，继续培养24 h，用于后续实验。

1.2.2 MTT法检测顺铂对两组细胞生长的抑制情况 取两组对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度为1×105/mL，胰酶消化，用DMEM完全培养重悬，制成细胞悬液，按150 μL每孔接种于96孔培养板上，37 ℃、5%CO2培养至约80%融合，更换成无血清的DMEM培养基，加入梯度浓度的顺铂，继续培养48 h，实验终止前4 h每孔加入终浓度为5 mg/mL的MTT 10 μL，继续培养4 h。检测前弃去上清，每孔加入DMSO 100 μL，振荡5 min，在570 nm处检测各孔的吸光度(OD)值，使用酶标仪自带系统计算IC50。

1.2.3 细胞周期和细胞凋亡检测 使用75%的乙醇溶液重悬细胞，-20 ℃过夜，磷酸缓冲液洗涤后，滴加终浓度为0.2 μg/μL核糖核酸酶，37 ℃静置30 min，滴加终浓度为50 μg/mL碘化丙啶染色液，4 ℃反应10 min，上流式细胞仪检测各周期细胞比例。使用Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡情况，操作严格按试剂盒说明进行。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测 Trizol法提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒得到cDNA。CKMT1A及内参β-actin引物合成由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成，CKMT1A引物序列：上游5′-GTCAGACCTATGTGACTAGATCGCA-3′，下游5′-CAGGAGATCTCAGT CTTGACCGG-3′；β-actin引物序列：上游5′-CCTAGCCGTTTCCGCTCC-3′，下游5′-CTGACTGATGGAGTACTTCTAGG-3′。扩增条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，60 ℃ 20 s，共40个循环，延伸72 ℃ 60 s。扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，通过CKMT1A目标条带与内参β-actin的比值计算得到CKMT1A mRNA的相对表达量。

1.2.5 Western blot检测 RIPA提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量，行SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转膜至PVDF，室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h，滴加一抗：小鼠抗人CKMT1A单克隆抗体(1∶500)，小鼠抗人c-PARP、BCL-2单克隆抗体(1∶200)，兔抗人Bax单克隆抗体(1∶400)，小鼠抗人STAT3、p-STAT3单克隆抗体(1∶500)，4 ℃过夜，滴加HRP标记的二抗，室温反应1～2 h，滴加ECL显色液，避光显影，以β-actin为内参对照计算各条带灰度值。

1.3 统计学分析

使用SPSS20.0软件分析，剂量资料以均数±标准差表示，组间比较进行t检验；计数资料以百分比(%)表示，组间比较进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 过表达CKMT1A人鼻咽癌细胞株HONE1建立及鉴定

分别使用浓度为0、2、4、8、16 μmol/L的顺铂处理HONE1细胞6 h后进行实时荧光定量PCR检测，结果显示，在低浓度顺铂(0、2、4 μmol/L)作用下，CKMT1A mRNA表达水平上升，分别为(1.05±0.02)、(1.68±0.06)、(1.71±0.08)；高浓度顺铂(8、16 μmol/L)作用下，CKMT1A mRNA表达水平下降，分别为(0.73±0.05)、(0.15±0.03)。可推测CKMT1A表达水平可能与HONE1细胞对顺铂的敏感性有关。因自然条件下CKMT1A在HONE1细胞中的表达水平较低，因此本实验使用pCMV-Neo-Bam-CKMT1A质粒对HONE1细胞进行过表达，转染24 h后，荧光显微镜下观察显示CKMT1A表达水平明显提升，转染率为86%；进一步行Western blot检测显示，CKMT1A过表达组CKMT1A蛋白相对表达量为(4.18±0.72)，明显高于空载体质粒组的(1.24±0.31)，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1，图2。

图1 pCMV-Neo-Bam-CKMT1A质粒转染前后荧光显微镜观察(200×)A转染前；B转染前后

图2 Western blot检测两组细胞中CKMT1A蛋白的表达1：空载体对照组；2：CKMT1A过表达组

2.2 不同浓度顺铂对两组细胞的生长抑制情况

向两组细胞培养液中加入梯度浓度的顺铂，浓度范围0～16 μmol/L，MTT法检测细胞生长情况显示，随着顺铂浓度的增加，两组吸光度值均呈下降趋势，其中CKMT1A过表达组下降幅度更明显；计算CKMT1A过表达组IC50为2.85 μmol/L，明显低于空载体对照组的4.51 μmol/L(P<0.01，表1)。

表1 不同浓度顺铂对两组细胞的生长抑制情况(OD值)

2.3 各周期细胞比例分布情况比较

空载体对照组与CKMT1A过表达组各周期细胞比例分布情况之间差异无统计学意义(P>0.05)；根据顺铂IC50结果选取2 μmol/L顺铂处理细胞24 h后，两组细胞均表现为G0/G1期比例明显下降，S期和G2/M期比例明显增多，其中CKMT1A过表达组与空载体对照组相比变化更明显(P<0.01)。见表2。

2.4 细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达情况比较

2 μmol/L顺铂处理细胞48 h后，CKMT1A过表达组细胞凋亡率为(19.47±0.75)%，明显高于空载体对照组的(10.92±0.86)%(P<0.01)。Western blot检测显示，空载体对照组与CKMT1A过表达组c-PARP、Bax、BCL-2蛋白相对表达量之间差异无统计学意义(P>0.05)。2 μmol/L顺铂处理细胞48 h后，两组细胞中c-PARP、Bax相对表达量明显升高，BCL-2相对表达量明显下降(P<0.05)；其中CKMT1A过表达+2 μmol/L顺铂组c-PARP、Bax相对表达量明显高于空载体对照+2 μmol/L顺铂组，BCL-2相对表达量明显低于空载体对照+2 μmol/L顺铂组(P<0.05)。见图3，表3。

表2 各周期细胞比例分布情况 (%)

与空载体对照组比较，aP<0.05；与CKMT1A过表达组比较，bP<0.05；与空载体对照+2 μmol/L顺铂比较，cP<0.05

图3 凋亡相关蛋白在各组细胞中表达的Western blot电泳条带1：空载体对照组；2：空载体对照+2 μmol/L顺铂；3：CKMT1A过表达组；4：CKMT1A过表达+2 μmol/L顺铂

组别c-PARPBaxBCL-2空载体对照组1.03±0.070.26±0.045.79±0.61CKMT1A过表达组1.19±0.090.29±0.045.82±0.55空载体对照+2 μmol/L顺铂1.88±0.24a0.52±0.08a7.14±0.20aCKMT1A过表达+2 μmol/L顺铂3.35±0.30bc0.75±0.11bc0.97±0.17bc

与空载体对照组比较，aP<0.05；与CKMT1A过表达组比较，bP<0.05；与空载体对照+2 μmol/L顺铂比较，cP<0.05

2.5 各组细胞STAT3磷酸化水平比较

空载体对照组与CKMT1A过表达组p-STAT3、STAT3蛋白相对表达量之间差异无统计学意义(P>0.05)。经查询相关文献显示，STAT3磷酸化多发生于药物诱导6 h[8]，因此本研究使用2 μmol/L顺铂处理细胞6 h后，空载体对照+2 μmol/L顺铂组p-STAT3相对表达量明显高于空载体对照组，CKMT1A过表达+2 μmol/L顺铂p-STAT3相对表达量明显低于CKMT1A过表达组(P<0.05)；其中CKMT1A过表达+2 μmol/L顺铂组p-STAT3相对表达量明显低于空载体对照+2 μmol/L顺铂组(P<0.01)。见图4，表4。

图4 凋亡相关蛋白在各组细胞中表达的Western blot电泳条带1：空载体对照组；2：空载体对照+2μmol/L顺铂；3：CKMT1A过表达组；4 ：CKMT1A过表达+2 μmol/L顺铂

组别p-STAT3STAT3空载体对照组0.09±0.022.96±0.32CKMT1A过表达组0.11±0.023.07±0.30空载体对照+2 μmol/L顺铂0.74±0.09a3.11±0.36CKMT1A过表达+2 μmol/L顺铂0.02±0.01bc3.02±0.28

与空载体对照组比较，aP<0.05；与CKMT1A过表达组比较，bP<0.05；与空载体对照+2 μmol/L顺铂比较，cP<0.01

3 讨 论

鼻咽癌患者的临床治疗中，放射治疗是首选方案，对于晚期、转移、复发的患者常联合化疗[8]。铂类药物被广泛用于多种实体肿瘤的治疗，其中顺铂对鼻咽癌具有较好的疗效，但随着疗程的延长，多数患者会出现对顺铂的耐药性，是导致病情复发、肿瘤转移的主要原因之一[9]。因此，探索铂类化疗药物的抵抗机制具有重要意义。线粒体具有氧化磷酸化、储存钙离子、传递电子等多种生理学作用，可介导细胞凋亡的发生[10]。CKMT1A是细胞凋亡和线粒体氧化磷酸化的主要分子之一，广泛存在于胃癌、肝癌、肺癌等肿瘤组织中，其表达水平与肿瘤的发展明显相关，但CKMT1A在鼻咽癌组织和细胞中表达的相关研究仍十分少见。本研究通过细胞转染技术在人鼻咽癌细胞株HONE1中高表达CKMT1A，旨在探讨CKMT1A与人鼻咽癌细胞对顺铂敏感性的关系。

本研究显示，随着顺铂给药浓度的增加，空载体对照组与CKMT1A过表达组的人鼻咽癌细胞生长均明显受限，说明铂类化疗药物顺铂对人鼻咽癌细胞具有明显的药效学作用，其中CKMT1A过表达组的人鼻咽癌细胞生长受限程度更明显，IC50明显低于空载体对照组，提示CKMT1A高表达提升了人鼻咽癌细胞对铂类化疗药物的敏感性。细胞周期检测显示，CKMT1A过表达可明显促进经顺铂处理的人鼻咽癌细胞在G2/M期的阻滞，有利于促进细胞凋亡。进一步通过细胞凋亡实验发现，2 μmol/L顺铂处理48 h后，CKMT1A过表达组人鼻咽癌细胞凋亡率明显高于空载体对照组，且c-PARP、Bax蛋白表达水平明显增加，相关研究显示，BCL-2蛋白表达水平明显下降。PARP在细胞DNA修复和基因稳定方面具有重要调控作用，与细胞凋亡密切相关，在DNA损伤或应激状态可激活生成c-PARP，c-PARP在修复损伤基因的过程中消耗细胞中大量ATP，导致细胞死亡[11]，同时c-PARP能够刺激线粒体分泌凋亡诱导因子，促进细胞凋亡[12]。促凋亡蛋白Bax的基因组可编码一种BCL-2家族的前凋亡蛋白，作为线粒体表面的细胞刺激和损伤传感器，能够破坏抗凋亡蛋白BCL-2的正常生理功能[13]。本研究中CKMT1A过表达可促进顺铂处理后的人鼻咽癌细胞中c-PARP、Bax蛋白表达，抑制BCL-2蛋白表达，进而发挥促人鼻咽癌细胞凋亡的作用。

STAT蛋白是一类存在于细胞质中的转录因子，受生长因子、细胞因子刺激后可被激活，进入细胞核调控基因表达，影响细胞增殖、分化和凋亡[14]。STAT3是近年来发现的STAT蛋白家族新成员，激活后的p-STAT3调控多种肿瘤细胞的生长和凋亡[15]。为进一步探究CKMT1A过表达在促进人鼻咽癌细胞对顺铂化疗敏感性的分子机制，本研究检测了顺铂处理6 h后人鼻咽癌细胞中STAT3、p-STAT3蛋白表达水平，结果显示，CKMT1A过表达+2 μmol/L顺铂p-STAT3相对表达量明显低于CKMT1A过表达组，而空载体对照+2 μmol/L顺铂组p-STAT3相对表达量明显高于空载体对照组，提示过表达CKMT1A可通过相关分子机制下调STAT3磷酸化水平，抑制靶基因表达，提升人鼻咽癌细胞对铂类化疗药物的敏感性，与上述相关研究结论一致。