原发性肝癌组织中STMN1及Cav-1蛋白的表达及其在预后评估中的意义

黄建 包大伟 刘文杰 周武碧 吴涵 李秀芳 张千 张正卫

原发性肝癌是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤[1]，每年约有75万新病例确诊，近50万患者死于肝癌[2]。因此，识别与肿瘤侵袭、转移相关的生物学标记物，可为肝癌的诊治及改善预后提供新靶点。微管去稳定化磷蛋白1(Stathmin-1，STMN1)是一种近年来研究广泛的微管蛋白，可参与信号通路的调节。有研究发现，STMN1在多种肿瘤组织中表达上调，与癌症的肿瘤恶性程度、侵袭和迁移有关[3]。小窝蛋白-1(Caveolin-1, Cav-1)是一种具有参与信号转导等细胞活动功能的支架蛋白[4]。经研究证实，Cav-1的表达水平与癌症转移呈正相关[5]。本研究旨在探讨STMN1和Cav-1在原发性肝癌组织中的表达水平，并进一步评估其临床病理和预后价值。

资料与方法

一、一般资料

收集我院2015年1月至2017年9月手术切除的新鲜肝癌组织与癌旁组织标本107例。收集患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤分期、TNM分期等临床病理参数。所有组织标本立即采集，液氮冷冻保存，以备进一步研究。取部分组织用10%多聚甲醛固定、石蜡包埋。参与本临床试验和研究前，均已取得患者书面知情同意，研究方案经我院伦理委员会批准。排除标准：1)临床病理资料不完整；2)存在其他系统组织器官恶性肿瘤；3)接受过术前治疗，如化疗、放疗或其他相关抗肿瘤治疗。患者临床病理特征见表1。对术后患者以电话、上门、门诊或住院的方式进行定期随访，记录患者预后情况(包括复发、转移及死亡情况)。

二、研究方法

(一)免疫组化SP法 采用免疫组织化学SP染色法检测肝癌和癌旁组织中TMN1和caveolin-1的表达水平。操作如下：(1) 石蜡包埋标本切片(4 μm)表面覆盖APES(Sigma，美国)；(2) 染色前切片经水冲洗，室温48 h晾干；(3) 二甲苯切片脱蜡，经梯度乙醇水化；(4) 3%过氧化氢溶液室温处理15 min，阻断内源性过氧化物酶活性；(5) 95 ℃，0.1 mol/L柠檬酸缓冲浸泡20 min，后用PBS冲洗；(6) 分别用兔抗人多克隆抗体STMN1(1∶50，Cell Signaling，美国)和兔抗人多克隆抗体Cav-1(1∶50，Santa Cruz Biotechnology，美国)4℃孵育过夜；(7) 用生物素标记的山羊抗兔IgG(1∶2 000，Zsbio，中国)室温孵育20 min；(8) 用过氧化酶标记的链霉菌素室温孵育20 min；(9)切片用DAB显色，苏木精复染；(10) 切片冲洗、干燥、中性胶封片，显微镜下观察。已知阳性反应片为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。

(二)结果判断 STMN1以细胞质出现浅黄色、棕黄色或棕色颗粒为阳性表达，Cav-1以细胞膜或胞质出现黄褐色或褐色颗粒为阳性表达。每张切片随机选取5个高倍视野，根据染色强度确定表达水平：与阴性对照相同为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分；根据观察细胞中阳性细胞的比例评分：着色细胞比例<5%为0分，5～25%为1分，>25%～50%为2分，>50～75%为3分，>75%为4分。最后通过染色强度分数乘以阳性细胞百分比计算最终得分，≥3分为阳性，<3分为阴性。

三、统计学处理

结 果

一、肝癌组织和癌旁组织STMN1和Cav-1表达

肝癌组织STMN1蛋白阳性比68.22%、Cav-1蛋白阳性表达率为69.16%，显著高于癌旁组织(P<0.05)，见表1。

表1 STMN1、Cav-1与临床特征的关系比[例(%)]

续表1

注：a表示与未发生分化比较，P<0.05，b表示与无转移比较，P<0.05，c表示与TNM0期比较，P<0.05，d表示与未累及肝被膜比较，P<0.05

二、STMN1、Cav-1的表达与肝癌临床病理特征的关系

STMN1蛋白表达水平与患者肝癌肿瘤中分化、发生转移及TNM的I-II期显著相关(P<0.05)，但与其他变量如性别、年龄、HBsAg阳性表达等无明显相关性(P>0.05)。Cav-1蛋白表达水平与患者肝癌肿瘤中低分化程度、发生转移及癌组织累及肝被膜显著相关(P<0.05)，但与其他变量无明显相关性(P>0.05)，见表1。

三、STMN1与患者预后状况相关性分析

STMN1蛋白在阳性患者生存时间中位数为28.30个月，阴性患者平均生存时间为34.50个月，差异具有统计学意义(P<0.05)。

五、Cav-1与患者预后状况相关性分析

Cav-1蛋白在阳性患者中位生存时间为33.10个月，阴性患者平均生存时间为39.10个月，差异具有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

STMN1是一种不稳定微管调节蛋白，在多种癌症中高表达[6, 7]。Tan等在原发性结直肠肿瘤细胞中检测到STMN1水平上调，且与肿瘤细胞的迁移、侵袭、黏附活动呈正相关[8]。本研究证实，STMN1蛋白在肝癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织，且与肝癌组织的分化程度、转移及进展情况有关，这与Tan等的研究结果一致。本研究还证实，可通过检测肝癌患者癌组织中的STMN-1表达水平预测肝癌的转移及预后情况。

有研究发现Cav-1在一些肿瘤组织中的表达水平明显高于正常组织。Tse等在肝癌及相关细胞系中发现Cav-1蛋白表达水平上调[9]。此外，Cav-1的高表达与肿瘤静脉浸润及转移有关，提示我们Cav-1蛋白的高表达水平可能促进了肿瘤的发生、进展、浸润和转移。本研究通过检测肝癌组织中Cav-1表达，与多种病理学特征进行相关性分析发现，Cav-1与肝癌的分化、侵袭和转移有关。另外，术后随访证实患者的生存时间与Cav-1蛋白的表达情况显著相关，这与Tse等的研究结果类似。提示STMN1和Cav-1对肝癌的治疗和预后预测有一定指导意义。