妊娠期肝内胆汁淤积症JNK信号通路的动物实验研究

郁平 姬小凡 王敏 徐晓艳

妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)是妊娠期常见病，也是诱发胎儿窘迫、早产的重要原因，部分孕妇可能造成死胎等严重后果。ICP发生后肝脏正常代谢功能紊乱，近年来报道显示，信号通路作用失调是ICP后引起肝功能异常的重要环节[1]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是丝裂原蛋白激酶家族的重要成员，可介导肝内多种细胞的生长代谢。覃春美等[2]认为JNK异常激活可诱导肝细胞损伤，并影响肝内胆汁代谢。本研究建立ICP动物模型，分析JNK与ICP的关系，旨在进一步探讨ICP发病机制，为临床干预提供借鉴。

资料与方法

一、一般资料

实验大鼠均由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，纳入40只清洁级SD雌性大鼠和10只雄性大鼠作为实验动物，体质量(220.78±14.92)g，鼠龄(165.15±20.39)d；以充足饲料和清水常规喂养，在发情期将雌性和雄性大鼠按4∶1比例同笼喂养。观察阴栓脱落情况，以阴栓脱落为妊娠成功。至妊娠第15 d，随机将40只雌性大鼠分为观察组和对照组，每组20只。观察组体质量(225.76±18.23)g；鼠龄(174.47±16.79)d。对照组体质量(227.05±17.70)g；鼠龄(176.98±15.56)d。两组大鼠体质量、鼠龄比较差异无统计学意义(P > 0.05)。

二、ICP建模

观察组大鼠在常规喂养基础上，自妊娠第15 d开始，自大鼠后肢皮下注射孕酮(国药准字H31021265，上海通用药业股份有限公司，规格1 mL∶0.25 g已酸羟孕酮，5 mg戊酸雌二醇)，75 mg/(kg·d)，同时注射α乙炔雌二醇(美国Sijma公司提供，货号：1260001，以1 mL精油配伍0.2 mg α乙炔雌二醇比例备制待用)，1.25 mg/(kg·d)，连续给药干预5 d。对照组大鼠继续常规喂养。两组大鼠均在妊娠后第3周取眶静脉取血1 mL，处死大鼠，取肝组织标本。

三、实验室检测

(一)血清总胆红素(TBil)检测 将眶静脉血1 mL，3 000 r/min离心10min，取上清液，采用全自动血液生化分析仪检测血清TBil水平。HD-F2600型生化分析仪由济南汉方医疗器械有限公司提供。

(二)免疫印迹法 检测磷酸化JNK：取50 mg大鼠肝组织，研磨后置入EP管中进行裂解，离心15 min后取上清液备用，取10 μL冷冻，室温下解冻，PBS液溶解稀释20倍，余上清液与5倍样品缓冲液混合，按40 mL/管分装，加热变性5 min后冷却备用。每孔加入200 μL工作液，混匀后37 ℃下孵育30 min，取微孔板，在550 nm下测量吸光度，计算蛋白浓度。

(三)免疫组化法 检测大鼠肝组织JNK阳性细胞数：取大鼠肝脏石蜡标本，一次进行脱蜡、梯度水化及抗原修复处理，完成后漂洗，用5%BSA封闭液室温封存标本1 h，去封闭液，以1∶50稀释一抗抗体，滴入标本组织，4 ℃孵育过夜。去一抗液，漂洗，取切片，甩尽TBST液，滴加显色液DAB工作液50 μL，室温孵育15 min，观察标本颜色，结果以阳性细胞数所占百分比和染色结果计分乘积评估结果，以得分≥4分为结果阳性[3]。具体评分标准为：阳性细胞数，无(0分)、<50%(1分)、50%～75%(2分)及>75%(3分)；染色结果，无(0分)、浅黄色(1分)、黄色(2分)及棕黄色(3分)。

四、观察指标

记录两组大鼠TBil、JNK信号通路蛋白表达量及JNK阳性细胞数，比较两组大鼠TBil水平、JNK信号通路及JNK阳性细胞数。

五、 统计学方法

结 果

一、两组TBil和JNK

观察组大鼠血清TBil和肝组织中JNK蛋白表达量分别为(8.94±2.58)μmol/L和1.57±0.48，对照组分别为(6.19±2.14)μmol/L和1.16±0.63，两组间比较差异有统计学意义(t值分别为3.669和2.315；P值分别为0.001和0.026)。40只雌性大鼠TBil与JNK蛋白表达量呈显著正相关(r=0.455，P=0.000)。见图1。

图1 TBil与JNK蛋白表达量线性关系分析

二、两组免疫组化结果比较

观察组大鼠JNK阳性者15只，占75%，对照组JNK阳性者7只，占35%。两组小鼠JNK细胞阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=6.465，P=0.011)。

A：JNK阴性；B：JNK阳性

图2大鼠肝组织JNK免疫组化染色结果(DAB200)

讨 论

JNK属促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员，既往报道显示，JNK存在3个不同编码基因，其中JNK1和JNK2在各种组织中广泛存在，并通过c-Jun、ATF2及p53等下游底物发挥生物学效应。JNK信号通路的调节主要依赖于MAPK激酶的识别和支架蛋白组合信号复合物[4]，从而介导细胞生长因子的代谢凋亡。傅应亚等[5]研究发现，JNK信号通路可直接调控胞质内Bim和Bcl-2等靶蛋白的活性，是肝脏损伤重要的调控因子。ICP患者以肝细胞和胆小管的色素沉着为主要病理表现，随着胆汁淤积的加重，逐渐发生肝组织损伤。胆汁淤积是JNK信号通路磷酸化重要的刺激因素，目前认为信号通路激活与功能蛋白表达相关[6]，本研究分析ICP大鼠模型TBil与JNK蛋白表达量的关系，发现二者具有正相关性，提示JNK的异常激活可能增加TBil水平，进而影响胆汁淤积症患者肝功能状态。另外，本研究还对比了两组大鼠模型肝组织中JNK表达量，结果发现差异有统计学意义，而陈秋玲等[7]的实验结果也显示，JNK抑制剂有助于调节胆汁酸转运蛋白水平，进而改善胆汁淤积程度，说明JNK参与ICP过程，纠正JNK信号通路异常可能有助于改善临床症状。

目前，临床对JNK信号通路与ICP的关系尚未完全阐明，Vucur 等[8]一项报道认为，JKN异常可能是肝组织代偿性增殖作用障碍的原因之一，影响肝脏自我修复功能，使肝功能持续降低，进而导致TBil异常升高，胆汁淤积。同时胆汁酸可激活TGR5胆汁酸受体，抑制JNK和Caspase复合物的形成，并上调死亡受体5表达水平，诱导肝细胞损伤和肝纤维化进程，因而推测JNK信号通路异常与胆汁酸可能存在相互作用关系，使ICP持续进展。ICP孕妇胎盘微绒毛数量减少，部分内质网相互融合而成束状，滋养细胞发生固缩，这些变化使胎盘物质交换效能降低，成为胆汁淤积的诱因。而JNK不仅参与肝细胞增殖分化，而且对细胞形态和骨架的维持具有调控作用，Dada等[9]认为JNK同源重组基因敲除会使其上游调节分子缺失，并加快病程进展，这也说明JNK信号通路在疾病发生、发展过程中发挥重要作用。因而，对于ICP患者，JNK信号通路的正常调控有助于改善胆汁酸代谢，缓解胆汁淤积状态。另外，JNK还可能与Smad、ERK等其他信号通路相互作用，形成复杂的调控网络，起到加强调控的作用，这有待于今后进一步深入研究。