针毛鳞盖蕨不同溶剂萃取物抗氧化及其抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

陆 怀,李红锐,黄相中,孙静贤,陈毅坚,李育逵,高利斌,王 韦,田 凯

(云南民族大学 民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室，云南 昆明 650500)

针毛鳞盖蕨(Microlepiatrapeziformis(Roxb.)Kuhn)是姬蕨科(Dennstaedtiaceae)鳞盖蕨属(Microlepia)植物,在我国主要分布于广西、台湾、云南等地.通常生长于林下沟中[1].植物多酚是一种植物体内具有多元酚结构的重要次生代谢产物[2],具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒、降血糖等作用[3-5].据文献[6-7]报道,存在于药用蕨类植物中的酚类化合物具有抗菌、止血、利尿、驱虫、抗肿瘤等生物活性.目前,还未见到对针毛鳞盖蕨乙醇粗提物及不同溶剂萃取物的多酚含量、抗氧化及其抑制α-葡萄糖苷酶活性研究的相关报道.为了解针毛鳞盖蕨的活性部位所在,本文采用福林酚法对针毛鳞盖蕨乙醇粗提物及不同溶剂萃取物进行多酚含量测定,通过DPPH·清除法和ABTS+·清除法比较乙醇粗提物及各萃取物的体外抗氧化能力,利用PNPG法对乙醇粗提物及各萃取物抑制α-葡萄糖苷酶活性进行评价.

1 实验材料

1.1 样品材料

实验用鳞盖蕨属植物针毛鳞盖蕨2017年3月采自云南玉溪,经云南大学陆树刚教授鉴定为M.trapeziformis,凭证标本 (No.20170314)存放于云南民族大学民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室的标本室.

1.2 主要试剂

没食子酸购买于北京市通广精细化工公司;4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)购买自美国Sigma公司;Vc (抗坏血酸)购买于天津市永大试剂有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基自由基 (DPPH)和2,2-联氮-二 (3-乙基-苯并噻吩-6-磺酸)二铵盐 (ABTS)均购买于梯希爱 (上海)化成工业发展有限公司;过硫酸钾购自天津市津东天正精细化学试剂厂;福林酚试剂购自上海荔达生物科技有限公司;α-葡萄糖苷酶和阿卡波糖均购于北京索莱宝科技有限公司;乙醇为分析纯,水为超纯水.

1.3 仪器与设备

JHF-350 型高速多功能粉碎机购于昆明铁申商贸有限公司;AL104 型电子天平购于云梅特勒-托利多仪器 (上海)有限公司;AS20500A 型超声清洗仪购于云南科仪化玻有限公司;N-1100D-WD 型旋转蒸发仪购于上海爱博郎仪器有限公司;Eppendorf 型单道移液器购买于德国 Eppendorf 公司;722 型分光光度计购于上海现科分光仪器有限公司.

2 实验方法

2.1 针毛鳞盖蕨多酚类化合物的提取

针毛鳞盖蕨粉末 20.0 g,用体积分数95%的乙醇回流提取3次,合并滤液减压浓缩,得针毛鳞盖蕨乙醇粗提物,将浸膏混悬于适量的水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、将萃取液合并,减压浓缩分别得到各部分萃取物.

2.2 多酚含量的测定

2.2.1 标准曲线的建立

准确称取干燥的没食子酸标准品 2.5 g,加蒸馏水溶解,配制成 25 μg/mL 的没食子酸标准溶液[8-10].分别准确移取0.00、0.10、0.20、0.40、0.80、1.20、2.00 mL 没食子酸标准品溶液于 100 mL容量瓶中,加蒸馏水定容,制备成不同浓度没食子酸标准品溶液.分别准确移取 1 mL 于比色管中,加入 5 mL 稀释10倍的福林酚试剂,溶液充分摇匀,静置 5 min,最后向各比色管加入 4 mL 7.5% Na2CO3水溶液,摇匀,静置 60 min.以试剂空白为参比,在波长 760 nm 条件下测定其吸光值 (A).以没食子酸质量浓度 (μg/mL)为横坐标,以吸光值 (A)为纵坐标,绘制标准曲线,并计算回归方程.

2.2.2 样品多酚含量的测定

准确移取提取物与各萃取物 1 mL (1 mg/mL)于比色管,于吸收波长为 760 nm 处测定其吸光度,按照准曲线方程计算乙醇粗提物和各萃取物中多酚含量.

2.3 抗氧化活性的测定

2.3.1 DPPH·清除力的测定

用体积分数 95%乙醇配制浓度为 0.15 mmol/L的DPPH溶液,避光保存[11-12].取 2 mL 已配制好的不同浓度 (5～100 μg/mL)样品液与 2 mL DPPH溶液混合,摇匀,室温静置 25 min,于 517 nm 波长处测吸光值.各组实验重复3次,取平均值.以Vc作阳性对照.计算DPPH·清除率.

式中:Ai为样品溶液与DPPH溶液混合后的吸光值;Aj为样品溶液与体积分数95%乙醇混合后的吸光值;A0为无水乙醇与DPPH溶液混合后的吸光值.

2.3.2 ABTS+·清除力的测定

用去离子水配制浓度为 7 mmol/L的ATBS储备液,加K2S2O8固体,使混合液中K2S2O8浓度为2.45 mmol/L,避光静置 2 h 后加入体积分数为 95%乙醇稀释成工作液[13-15],使其在 734 nm 处测得吸光值A0=0.7±0.020.取 0.5 mL 已配制好的不同质量浓度 (5 ～100 μg/mL)样品液与 2.5 mL ABTS溶液混合,摇匀,室温静置 5 min,测其吸光值,以Vc为阳性对照,各组实验平行3次.计算ABTS﹢·清除率.

式中:A0为样品溶液与ABTS溶液混合后的吸光值;Aj为95%乙醇与ABTS溶液混合后的吸光值.

2.4 抑制α-葡萄糖苷酶活性的测定

采用PNPG法测定针毛鳞盖蕨乙醇粗提物及不同溶剂萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性[16-18].实验设置4个组,每组3个复孔,加PBS缓冲液补满总体积,为 150 μL.各孔依次加入 50 μL PBS缓冲液、10 μL DMSO溶解的待测液溶液及 20 μLα-葡萄糖苷酶溶液,在 37 ℃恒温反应 5 min 后各孔均加入 2.5 mmol/L PNPG溶液 20 μL,30 ℃下继续恒温反应 15 min,加入 0.2 mol/L Na2CO3终止液 50 μL,于 400 nm波长下测定吸光值.乙醇粗提物及不同溶剂萃取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性计算公式:抑制率 (%)=[(B-B0)-(A-A0)]/(B-B0)×100%,进一步计算其半数抑制浓度 (IC50)值.

其中,样品组 (A):适量PBS缓冲液+10 μL DMSO溶解的待测样品溶液+20 μLα-葡萄糖苷酶溶液+20 μL PNPG溶液+50 μL Na2CO3终止液;样品对照组 (A0):适量PBS缓冲液+10 μL DMSO溶解的待测样品溶液+50 μL Na2CO3终止液;酶活性组 (B):适量PBS缓冲液+10 μL DMSO+20 μLα-葡萄糖苷酶溶液+20 μL PNPG溶液+50 μL Na2CO3终止液;酶空白组 (B0):适量PBS缓冲液+10 μL DMSO+50 μL Na2CO3终止液.

3 结果与分析

3.1 多酚含量测定结果

3.1.1 用没食子酸为参比标准衡量

针毛鳞盖蕨乙醇粗提物及不同溶剂萃取物中多酚含量,将没食子酸的质量浓度ρ(μg/mL)作为标准曲线的横坐标,吸光值A作为标准曲线的纵坐标,所得的回归方程为y=0.007 86x+0.005 41,R2=0.999 1绘制的标准曲线如图1.

3.1.2 多酚含量的测定

针毛鳞盖蕨乙醇粗提物及不同溶剂萃取物的多酚含量测定结果见表1.

表1 多酚含量测定结果

从表1可以看出乙酸乙酯萃取物的多酚含量最高 (34.8%),是多酚含量最低的正丁醇萃取物 (1.6%)的21.75倍.

3.2 抗氧化活性的测定

3.2.1 对DPPH·的清除能力

由图2可知,针毛鳞盖蕨乙醇粗提物及不同溶剂萃取物对DPPH·的清除作用大小顺序为:乙酸乙酯萃取物﹥石油醚萃取物﹥乙醇粗提物﹥正丁醇萃取物.乙醇粗提物与不同溶剂萃取物对DPPH·均显示出较强的清除能力,在实验浓度范围内,乙醇粗提物及各萃取物对DPPH·清除活性与其质量浓度呈正比关系,随质量浓度的增加而增强.在3种萃取物中,乙酸乙酯萃取物对DPPH·的清除能力最强,且高于乙醇粗提物,乙酸乙酯萃取物浓度为 19.8 μg/mL时,其清除率为50.0 %,乙酸乙酯萃取物浓度为 80.0 μg/mL时,其清除率达到饱和,并与阳性对照Vc的清除率相当.结合表1可知针毛鳞盖蕨乙醇粗提物及不同溶剂萃取物对DPPH·的清除作用与多酚含量呈正相关.

3.2.2 对ABTS+·的清除能力

由图3可知,针毛鳞盖蕨乙醇粗提物及不同溶剂萃取物对ABTS+·的清除作用大小顺序为:乙酸乙酯萃取物﹥石油醚萃取物﹥乙醇粗提物﹥正丁醇萃取物.乙醇粗提物与不同溶剂萃取物均具有较强的ABTS+·清除能力,在测试浓度范围内,乙醇粗提物及各萃取物清除ABTS+·的能力随其质量浓度的增加而增强.其中,乙酸乙酯萃取物在各浓度条件下均表现出最强的ABTS+·清除能力,其浓度为 28.5 μg/mL 时,清除率为50.0%,当浓度增加到 100.0 μg/mL 时,清除率高达86.1%,且接近于对照品Vc的清除率.结合表1可知针毛鳞盖蕨乙醇粗提物及不同溶剂萃取物对ABTS+·的清除能力强弱与其多酚含量的顺序一致.

3.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性

针毛鳞盖蕨乙醇粗提物及不同溶剂萃取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性见表2.

表2 针毛鳞盖蕨乙醇粗提物及不同溶剂萃取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性

从表2可以看出相对于阳性药阿卡波糖,其IC50为 (103.7±5.1)μg/mL,针毛鳞盖蕨乙醇粗提物和不同溶剂萃取物对α-葡萄糖苷酶活性均显示较好的抑制能力,其中乙酸乙酯萃取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用最强,IC50为 (5.3±0.8)μg/mL,而正丁醇萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用最弱,IC50为 (34.9±4.2)μg/mL.

4 结语

利用福林酚法研究针毛鳞盖蕨乙醇粗提物及3种不同溶剂萃取物的多酚含量,发现乙醇粗提物及不同溶剂萃取物的多酚含量都很高,表明针毛鳞盖蕨中多酚类化合物含量丰富,其中乙酸乙酯萃取物的多酚含量最高.进一步研究表明3种萃取物中乙酸乙酯萃取物在DPPH·清除法、ABTS+·清除法及PNPG法实验中显示出较强的抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶活性,且其活性高于乙醇粗提物.同时,乙酸乙酯萃取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力强于阳性药物阿卡波糖,但自由基清除能力弱于阳性对照品Vc,为进一步对针毛鳞盖蕨的开发和利用提供了实验依据.