衍生化HPLC/MS法测定有机羧酸物质的研究进展

张晨曦，卢爱玉，薛扬睿，孙崟喆，江弦，许风国，焦宇

(中国药科大学理学院，江苏 南京 211198)

小分子羧酸广泛存在于人体的糖代谢、氨基酸代谢等生命过程中是一类有重要生物学意义的分子。研究表明大约8%的待检测物质都包含羧酸官能团[1]。因此，灵敏且选择性高的羧酸化合物检测方法对于阐明这些羧酸化合物在生命系统中的功能和机制非常重要。

近年来小分子羧酸的检测主要依靠液相-质谱联用技术(LC-MS),特别是配备电喷雾离子源(ESI)的LC-MS/MS。然而使用ESI-MS检测羧酸类物质也面临着许多挑战。尽管羧酸类物质在负ESI-MS中可被检测到，但由于高背景噪声，检测的灵敏度并不理想。此外用于分离羧酸的流动相并不总是与ESI-MS兼容，这也限制了LC-MS对于羧酸的检测。

近年来化学衍生化法越来越多地应用于各种难检物质的检测，日益受到人们的关注。化学衍生化法是指通过化学反应将待测分子接上某种特定衍生化基团,从而改变化合物特性使其更适合于特定分析的过程。在LC-MS检测中应用化学衍生化法可以通过引入不同的衍生化基团使待测物更易被检出。

衍生化法常用的反应有酯化、酰化、烷基化、硅烷化、硼烷化、环化和离子化等，衍生化能够抑制样本碎片化，提高样本的挥发性和稳定性。将LC-MS与衍生化结合，可以提高LC-MS的分析能力，增大敏感度，弥补二者的不足。柱前衍生化法是LC-MS衍生化中最为重要的一种，其主要在色谱分离前预先将样品制为适当的衍生物，然后再进入色谱柱进行分离检测[2]。该方法可以使待测组分与衍生化试剂有选择性的反应，改变其出峰顺序而使其与样品中其他组分分离开，也可以使被测组分接上带有发色集团的衍生化试剂使本来不能被检测的组分得以被检测。

根据衍生化原理的不同,羧酸物质柱前衍生化方法可以分为：通过形成酰胺键进行衍生化和通过其他化学键进行衍生化。

1 通过形成酰胺键进行衍生化

Tatsuya Higashi在2012年开发了一种灵敏且选择性好的衍生化试剂1-[(4-二甲基氨基苯基)羰基]哌嗪(DAPPZ)，通过LC/ESI-MS/MS 的方式来检测非结合胆汁酸(BAs)在鼠脑中的含量。非结合胆汁酸中包含3种组分，脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)、胆酸(cholic acid,CA)、鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)。然而实际检测中，非结合胆汁酸在去质子化分子的碰撞诱导下不能解离产生特征性的离子，很难用LC/MS直接检测。Tatsuya Higashi使用的DAPPZ含有高活性ESI部分，在室温下它的哌嗪部分可以定量地与羧酸反应，形成酰胺键，见图1[3]。产物在ESI检测器上易被完全离子化，特征性离子可以被MS/MS准确检测出。实验结果表明利用DAPPZ的衍生化使CDCA的检测灵敏度提高了近75倍。

图1 BAs与DAPPZ的反应

在实际研究过程中，Shoujiro Ogawa 采用了一种全新合成的反应物N-(2-氨乙基)-4-(二乙胺基)苯甲酰胺(ADB)及其氘代类似物d-ADB为衍生化试剂，测定对羟基肉桂酸(HCAs)和水杨酸(HBAs)两种防氧化植物素含量。相比于常用的衍生化试剂DAPPZ，ADB和dADB的质子亲和力更高，衍生化后的检测灵敏度是使用DAPPZ时的2倍。在验证发酵后的大米在防治癌症方面的效果，及其中有效成分HCAs和HBAs两种防氧化植物素含量时，应用成果显著。为了验证食物中含有更多的HCAs和HBAs对人体健康有益，Shoujiro Ogawa采用ADB及d-ADB为衍生化试剂，与HCAs和HBAs在60 ℃下反应30 min，生成酰胺键[4]，见图2。该方法使这两种防氧化植物素在LC/ESI-MS/MS检测中变得既灵敏又准确。

图2 HCAs和HBAs与ADB或dADB的反应

Takahiro Takayama课题组在2014年开发了(S)-1-4，6-二甲氧基-(1,3,5-三嗪)-2-吡咯烷基-3-胺(DMT-1(S)-Apy)和(S)-4，6-二甲氧基-N-吡咯烷基-3-(1,3,5-三嗪)-2-胺(DMT-3(S)-Apy)衍生化试剂，为代谢组学方面的研究提供了新的思路。代谢组学研究对认知理解生理功能具有重要意义，代谢产物的浓度差异能够准确地反映身体状况，很多成熟的试剂已经被广泛使用。当机体患有某些疾病时，一些手性代谢产物的含量会发生明显变化。例如当机体患有精神分裂症或抑郁症时，与N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体功能有关的D-血清和D-丙氨酸的含量会增加[5]，但是检测信号的变化幅度并不大。Takahiro Takayama团队使用DMT-1(S)-Apy或DMT-3(S)-Apy作为衍生化试剂与羧酸类物质反应后(见图3)，检测信号可以增强67%，更容易判断这两种物质的含量变化，进而有助于医生对相关疾病做出诊断。

Tatsuya Higashi课题组在2015年开发了一种以(S)-阿纳巴辛(ANA)作为衍生试剂在LC/ESI-MS/MS中检出手性羧酸，并将其对映体分离的方法(见图4)。他们发现之前单纯地利用LC/ESI-MS/MS进行分离速度比较慢，灵敏度不够高,分离效果也不好。ANA在4-(4，6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-酰基)-4-甲基吗啉存在下，与羧酸[3-羟基吡啶酸(3-OH-PA)，2-(-羧乙基-6-羟基三甲基色曼(γ-CEHC)]和依托多酸反应迅速，形成酰胺键[6]。结果表明，ANA-衍生物在ESI-MS正离子模式具能高度响应，在MS/MS中产生特征产物离子，从而可以通过选择性的反应监测进行灵敏的检测。ANA-衍生物的测定响应比全羧酸提高了20～160倍，检出限在低浓度微孔范围(1.8～11 fmol)。

图3 羧酸类物质与DMT-1(S)-Apy或DMT-3(S)-Apy的反应

图4 手型羧酸与ANA的反应

Shoujiro Ogawa课题组还开发了一种新的衍生化试剂(S)-1-(4-二甲氨基苯基羰基)-3-氨基吡啶(1-DADAP)对手性羧酸在LC/MS中检出和分离(见图5)。不同于衍生化前的低灵敏度，低分离效果，1-DAPAP在4-(4，6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-酰基)-4-甲基吗啉存在下，与羧酸在室温下反应5 min。所得衍生物含有酰胺键，它在ESI-MS正离子模式下响应剧烈，在MS/MS中产生特征产物离子，使选择性反应监测的灵敏度提高。1-DAPAP-衍生物的检测响应比完整的羧酸在柱上提高10～1 100倍，检测范围分别为0.97 fmol。

图5 手型羧酸与1-DADAP的反应

利用ANA和1-DAPAP衍生化对手性羧酸的拆分都是有效的。尤其是1-DAPAP的衍生化对羧酸的拆分值为1.243，该衍生化方法能够成功地应用于生物样品分析。在实际应用中，经过衍生化后，人唾液中微量布洛芬和萘普生可以在LC/ESI-MS/MS得到很好的分离和检测，并且具有操作简单，样品用量小而灵敏度高的优点[7]。

Noortje de Haan的课题组在2015年使用羧酸活化剂二甲基胺(EDC)为衍生化试剂对唾液酸进行鉴别和定量。人的唾液是一种反应个体生理状态是否出现异常的重要生物样本。连锁特异性唾液酸衍生法(唾液酸糖基化)则是对翻译前后蛋白质进行修饰的方法，能够明显改变蛋白质构象，增大溶解度。但是，糖基化反应进行的程度往往不尽人意，于是Noortje de Haan使用EDC在60 ℃的条件下使唾液酸内酯化和二甲酰化(见图6)，产物在MS中的响应提高1～2倍[8]。该方法对样品中唾液酸实现了更灵敏的分析,为临床医疗提供了具有特异性的糖基化治疗性抗体。

Bryce J.Marquis带领的团队于2017年设计了一种新型有效的衍生化试剂：4-溴-N-甲基苄胺(4-BNMA)(见图7)。4-BNMA是一种在生物体内普遍存在的新型高效液相色谱-生物有机酸衍生化试剂，它含有羧酸官能团小分子，用于衍生单羧酸，二羧酸和三羧酸，研究三羧酸循环(TCA)[9]。使用4-BNMA后的6 min内，原羧酸浓度在0.2～44 μg之间的检测限可以提高2～3倍。该方法已成功应用于体内外模型。

2 通过其他化学键进行衍生化

Tao Ma课题组在2015年开发了一种衍生化试剂2-(5-苯并吖啶)乙基-对甲苯磺酸酯[10](BAETS)用来测定药材中三萜酸的含量。通过RP-HPLC-FLD-MS柱前衍生化法使用这种试剂可以同时测定5种三萜酸：积雪草酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和桦木酸。这个方法有利于更好地鉴定化学成分(见图8)。

图6 唾液酸与EPC的反应

图7 羧酸类物质与4-BNMA的反应

图8 三萜酸与BAETS的反应

Xian-En Zhao课题组在2016年设计了衍生化试剂 4-羰基氯罗沙明(CCR)来分析神经递质(NTs)的含量。NTs可能在神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)中发挥重要作用。为了研究它与疾病间潜在的联系，Xian-En Zhao 开发了一个新的简单、快速、准确基于原位超声辅助衍生化分散的灵敏分析方法。将液-液微萃取(原位UA-DDLLME)与UPLC-MS / MS相结合，用此方法成功进行了AD大鼠尿液中的氨基酸神经递质(AANT)和单胺神经递质(MANTs)的定量分析(见图9)。因为未经衍生化处理的NTs存在于生物样品中浓度低，化学性质不稳定，并且还存在共洗脱的潜在色谱干扰。所以在一个步骤中同时进行衍生化和分析物的微萃取可以简化分析样品提取步骤，减少样品和溶剂的消耗，提高灵敏度。这是一种在以前没有用于生物样品中NTs的分析手段。CCR用于分析NTs时有衍生条件温和，易于处理和检测灵敏度高等优点[11]。这种方法可能是阿尔茨海默病(AD)客观诊断的有效工具并且有益于进一步的神经疾病研究。

图9 NTs与CCR的反应

Chao Guo课题组在2018年设计出一种新衍生化试剂N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺直接量化体液中痕量生物学上重要的羧基化合物。这个创新性的方法可以检测许多羧酸类物质如：α-硫辛酸,2-(β-羧乙基)-6-羟基-2,7,8-三甲基苯并二氢吡喃，前列腺素E2，胆碱酸和唾液中的鹅去氧胆酸。该方法包括两个步骤：首先用N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺对目标分析物衍生化，然后进行HPLC-MS分析见图10，在实际应用中可以检测到低皮克每毫升水平[12]。

图10 羧酸类物质与N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺的反应

Uutela课题组在2019年发现以氯甲酸正丁酯作为衍生化试剂能够显著提高氨基酸检测的灵敏度。众所周知，氨基酸在食物、植物、生物样本中广泛存在，十分重要，并且也是一种有机羧酸。我们常用LC-MS/MS方法对氨基酸进行分析，柱前衍生化则有利于它的监测和分离。氨基酸衍生化的方法大概分为3种，即氨基参与反应，羧基参与反应和两者同时参与反应。Uutela 对比了3种氨基酸的衍生化试剂，氯甲酸-9-芴甲酯(与氨基反应)、丁醇(与羧基反应)、氯甲酸正丙酯(与氨基和羧基发生反应)见图11。发现后者与氨基酸反应既生成酯键又生成磺酰胺键衍生化效果最好[13]，在LC-MS/MS检测中敏感准确。

图11 氨基酸与氯甲酸正丁酯的反应

3 总结

在基于化学衍生化的色谱技术中有一些突出的特点:①衍生化反应快速高效且具有生物兼容性；②衍生化反应具有专一性,能够抑制碎片化，提高样本的挥发性和稳定性。且MS/MS碎片信息丰富；③可以同时进行衍生化和分析物的微萃取，简化分析样品提取步骤，减少样品和溶剂的消耗，提高灵敏度；④扩大检测限，增强分析物稳定。

柱前衍生化法具有很多优点,但是由于有些化合物经过衍生化后,有时会得到不止一种反应产物,因此每一个衍生反应的样品组分会有两个或更多的色谱峰,从而使色谱图复杂化,使得柱前衍生化法的使用受到一定的限制。对于种种方面，排除其他干扰，可以改良试剂，调整运行参数进行改良，同时，寻找更多符合衍生化试剂，提高灵敏度尤为重要。

4 展望

羧酸类物质在药学和生物医学的研究中十分常见，开发灵敏和有选择性的痕量化合物测定方法对于阐明它们在生命系统中的生物学作用和功能十分重要。近年来LC-MS常用于此目的，在之前的实验中证实了有许多最初应用在紫外和荧光检测中的有潜力的衍生化试剂，如今也可以被应用于LC-MS/MS分析中。并且也有许多全新的衍生化试剂专门为MS/MS 检测而设计合成。在未来，会有更多高选择性，敏感度的衍生化试剂被开发应用于羧酸类物质的LC-MS/MS检测分析中。