复方三维右旋泛酸钙糖浆对功能性消化不良大鼠的改善作用及机制研究

赵优琴，黄鸣清，钟晓琴，叶水国，苏志伟

(1.福建中医药大学药学院，福建省中药学重点实验室，福建 福州350122；2.国药控股星鲨制药<厦门>有限公司，福建 厦门361028)

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是临床常见的一种胃肠动力障碍性疾病，其典型症状包括反酸、腹胀、腹泻、早饱感等。胃肠动力障碍、内脏高敏性及心理因素等被认为是FD的主要发病机制，同时胃肠动力障碍也是FD发生的重要病理生理学基础[1]。研究表明，广泛分布于胃肠道的Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)是肠胃活动的重要调节者，其数量或结构的异常变化，可引起胃肠动力障碍；而ICCs特异性标志物c-kit受体与其天然配体干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)组成的SCF/c-kit信号通路，可调控ICCs的生长发育及其表型的维持，从而调节胃肠动力[2]。此外，水通道蛋白(aquaporins,AQPs)可高效、选择性地转运细胞内外的水分子以维持内环境的水液平衡，其在肠道的异常表达会导致肠道对水分的吸收减少，导致水分大量在肠腔聚集，最终形成腹泻[3]。

复方三维右旋泛酸钙糖浆(以下简称：复方糖浆)是一种中药复方制剂，含党参、白术、茯苓、山楂、山药等多味中药及多种B族维生素，临床用于治疗消化不良和小儿厌食。课题组前期研究发现复方糖浆可有效调节FD大鼠的胃肠运动，改善小肠吸收功能[4]，但其具体机制尚不清楚。因此本实验以此为基础，进一步考察复方糖浆对FD大鼠胃窦组织中SCF、Cx43、c-kit及结肠组织中AQP4、AQP8蛋白表达表达水平的影响，探讨复方糖浆治疗FD的可能分子机制，从而为该方剂的进一步开发及临床推广应用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠(体重180～200 g)，购于上海斯莱克实验动物中心，合格证号：SCXK(沪)2017-0005。于福建医科大学实验动物中心[使用许可证：SYXK(闽)2016-0006]适应性喂养7 d，室温(25±1)℃，自由饮水摄食。

1.2 药品与试剂 复方三维右旋泛酸钙糖浆[国药控股星鲨制药(厦门)有限公司，批号：20970104]；多潘立酮片(西安杨森制药有限公司，批号：180306533)；氯化钠注射液(江西科伦药业有限公司，批号：C18082207)；水合氯醛(阿拉丁，批号：40935760)；大鼠胃泌素ELISA试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司，批号：CSB-E12743r)；大鼠VIP酶联免疫检测试剂盒(上海西塘生物科技有限公司，批号：f17131)；抗AQP4抗体(Abcam公司，批号：ab9512)；抗AQP8抗体(Abcam公司，批号：ab14363-2)； 抗c-kit抗体(Abcam公司，批号：ab5506)；抗Connexin-43抗体(PTG，批号：15386)；抗SCF抗体(Novusbio，批号：NBP1-77030)；抗β-Actin抗体(北京全式金生物，批号：HC201)。

1.3 仪器 XY2000C电子天平(常州市幸运电子设备有限公司)；Primo R高速台式冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技有限公司)；SK-1快速混匀器(常州国华电器有限公司)；Infinite 200 PRO多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)；ChemiDoc XRS+凝胶成像分析系统、Mini PROTEAN Tetra小型垂直电泳槽、转印槽(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分组与造模 48只合格大鼠随机分为正常组，模型组，复方糖浆低、中、高剂量组及多潘立酮组，每组8只。除正常组每日常规饲养不予造模外，其余各组均采用夹尾刺激(每天2次)+不规则饮食(逢单日禁食，饮水正常)+冰生理盐水灌胃(每次2 mL，每天1次)，连续造模2周，2周后若大鼠出现紧张易怒反应、进食量明显减少、体重明显减轻等情况，表明造模成功。

2.2 给药 根据前期研究基础[4]，复方糖浆低、中、高剂量组分别予复方糖浆2.7、5.4、10.8 g·kg-1，多潘立酮组给予多潘立酮4 mg·kg-1，正常组及模型组灌胃等体积生理盐水，于造模后第7天开始给药，每天1次，连续给药14 d。

2.3 小肠推进率、胃排空率测定及标本采集 末次给药结束后，大鼠禁食不禁水12 h，灌胃1 mL的炭餐指示剂，30 min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血后处死，即刻剖开腹腔，迅速剪取全胃，滤纸拭干后称全质量，沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后拭干后称净重，胃排空率=[1-(胃全重-胃净重)/所灌糊质重量]×100%；剪取距幽门0.5 cm处适量大小的胃窦组织，冰生理盐水冲洗后，置于冻存管中，液氮冻存；分离上至幽门下至回盲部的肠管，在松弛状态下测量并记录幽门至炭餐指示剂最前端的距离，记为炭餐指示剂推进长度，小肠推进率=炭餐指示剂推进长度/小肠总长度×100%；剪取近端结肠组织适量，冰生理盐水冲洗后，置于冻存管中，液氮冻存。

2.4 血清胃泌素(GAS)、血管活性肽(VIP)检测 各组大鼠取血后，4 ℃，3 500 rpm离心15 min，取上清分装，于-80 ℃低温冰箱保存备用。严格按照试剂盒说明操作，检测血清中的GAS、VIP水平。

2.5 组织中AQP4、AQP8、SCF、Cx43、c-Kit蛋白检测 取适量大小的胃窦组织和结肠组织，分别经液氮充分研磨，每100 mg组织样品中加1 mL含蛋白酶抑制剂的裂解液，1 mL注射器抽提数次充分匀浆，冰上静置30 min后，14 000 rpm离心10 min，取上清液。BCA法检测上清浓度，加入适量的蛋白上样缓冲液混匀、离心、变性、上样，每孔上样总量为40 μg蛋白，SDS-PAGE 凝胶电泳分离后，通过转膜仪将蛋白转移至PVDF膜，脱脂奶粉室温封闭2 h，4 ℃敷一抗过夜，隔天TBST洗30 min，室温敷二抗1.5 h，TBST洗30 min，ECL发光液显影，Image Lab软件分析目标条带灰度值。

3 结果

3.1 复方糖浆对FD大鼠腹泻等一般情况的影响 造模前，各组大鼠状态、毛色、体态等均正常。造模5 d后，各实验组大鼠烦躁易怒，大便湿软，食欲下降；造模7 d后，各实验组大鼠倦怠萎靡、静卧少动，粪便呈黄绿色不成形的稀便；经治疗14 d后，与模型组相比，复方糖浆各剂量组及多潘立酮组大鼠精神状态明显好转，活动量明显增加、毛色光泽，大便恢复正常。

3.2 复方糖浆对FD大鼠体重的影响 与正常组比较，模型组大鼠的体重明显降低(P<0.01)。与模型组比较，复方糖浆中、高剂量及多潘立酮组大鼠体重明显升高(P<0.05，P<0.01)，复方糖浆低剂量组大鼠体重与模型组相比也有一定程度的升高，但无统计学差异(P>0.05)，结果见表1。

3.3 复方糖浆对FD大鼠胃排空率及小肠推进率的影响 与正常组比较，模型组大鼠胃排空率和小肠推进率均显著降低(P<0.01)。与模型组比较，复方糖浆高剂量组及多潘立酮组大鼠的胃排空率及小肠推进率均显著升高(P<0.01)，复方糖浆中剂量组大鼠的胃排空率及小肠推进率亦有明显升高(P<0.05)，而复方糖浆低剂量组的胃排空率及小肠推进率与模型组相比无显著性差异(P>0.05)，结果见表1。

表1 复方糖浆对FD大鼠体重、胃排空率及小肠推进率的影响

注:与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.4 复方糖浆对FD大鼠血清GAS、VIP的影响 与正常组相比，模型组大鼠血清中GAS含量显著降低(P<0.01)，VIP水平显著升高(P<0.01)。与模型组相比，多潘立酮组及复方糖浆高剂量组GAS水平明显升高(P<0.01)，VIP水平明显降低(P<0.01)；复方糖浆中剂量组VIP水平显著降低(P<0.05)，而复方糖浆低剂量组的GAS、VIP水平与模型组相比无显著性差异(P>0.05)，结果见表2。

表2 复方糖浆对FD大鼠血清GAS、SCF、VIP的影响

注:与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.5 复方糖浆对FD大鼠胃窦组织中SCF、c-kit、Cx43蛋白表达的影响 与正常组相比，模型组SCF、c-kit、Cx43蛋白表达明显降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，复方糖浆高剂量组及多潘立酮组SCF、c-kit、Cx43蛋白表达显著升高(P<0.01，P<0.05)，复方糖浆中剂量组c-kit、Cx43蛋白表达明显增加(P<0.01，P<0.05)，复方糖浆低剂量组c-kit蛋白表达水平也明显增加(P<0.05)，结果见图1。

3.6 复方糖浆对FD大鼠结肠组织中AQP4、AQP8蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组AQP4、AQP8蛋白表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较，复方糖浆高剂量组及多潘立酮组AQP4、AQP8蛋白表达显著增加(P<0.01)；复方糖浆中剂量组AQP8蛋白表达明显增加(P<0.05)，但AQP4蛋白表达量无统计学差异(P>0.05)，结果见图2。

图1 复方糖浆对FD大鼠胃窦组织SCF、c-kit、Cx43蛋白表达的影响 注:与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

图2 复方糖浆对FD大鼠结肠组织AQP4、AQP8蛋白表达的影响(n=4) 注:与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

FD属中医学中的胃脘痛、嘈杂、痞满、纳呆、反酸等范畴，其诱因与脑肠轴失衡、内脏高敏、饮食失衡以及精神压力过大有密切联系，其中胃肠动力障碍是FD最重要的发病机制之一。目前西医多以促胃动力药等手段加以干预，虽可改善患者部分症状，但其方法单一，疗效不明显。中药具有多成分、多靶点、多途径等特点，其在治疗胃肠障碍性疾病方面具有疗效确切、副作用小等优势。现代研究表明，复方糖浆中党参、白术、芡实、山楂、山药补气益脾、健胃消食，可促进胃肠运动；茯苓、薏苡仁健脾渗湿、除湿止泻，可改善腹泻。此外，方中维生素B1、B2、B6、烟酰胺等B族维生素，可改善机体能量代谢，促进营养成分的吸收和利用能力。

ICCs是胃肠道基本动力单位“ENS(肠神经)-ICCs-SMCs(平滑肌细胞)”中最重要的协调者，也是治疗胃肠动力障碍的重要靶点[5]。Cx43是ICC细胞表达的主要连接蛋白，其表达降低会引起胃肠运动功能紊乱，干细胞因子受体(c-kit)是胃肠道ICCs的特异性受体，与Cx43存在共定位表达，c-kit与Cx43表达异常可引起胃肠运动功能的紊乱，SCF是c-kit的特异性配体，可与c-kit结合后激活一系列信号分子，从而调节胃肠动力[6-8]。GAS是一种广泛分布于整个胃肠道的脑肠肽，具有刺激胃酸、胃蛋白酶分泌的作用，可助消化和促进胃排空，血清GAS水平在一定程度上可以反映胃肠道的功能状态[9]。本研究表明，复方糖浆可促进FD大鼠GAS的分泌，上调胃窦组织中SCF、c-kit、Cx43蛋白的表达水平，增强胃肠平滑肌收缩，从而促进胃肠蠕动及胃排空。

腹泻作为FD典型症状中一种，与AQPs有着密切联系。研究表明，肠道AQP4异常表达会导致结肠对水分的吸收和分泌紊乱，进而引发腹泻[10-11]。肠易激综合征患者AQP8表达显著降低，使得结肠对水分的吸收明显减少，可导致粪便松散甚至腹泻[12-13]。此外，VIP是一种可以抑制胃肠运动的肠激肽，其水平异常增加会导致水分不能完全吸收，从而引起腹泻。本研究表明，复方糖浆可抑制FD大鼠VIP的分泌，调节结肠组织中AQP4、AQP8蛋白表达水平，进而改善FD大鼠的腹泻症状。

综上所述，复方糖浆可上调胃窦组织中SCF、Cx43、c-kit的蛋白表达，增强胃肠平滑肌收缩，促进胃肠动力活动，从而改善FD模型大鼠的胃肠功能障碍；并可通过增加结肠组织中AQP3、AQP4蛋白表达水平，平衡水液吸收，减少水液电解质在肠腔的累积，从而改善腹泻症状。