蛹虫草新型黄色素结构的初步鉴定及响应面优化提取工艺

唐鸿标，陈楚欣，林俊芳,*，娄海伟，叶志伟，郭丽琼,*

（1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；2.广东省微生态制剂工程技术研究中心，广东 广州 510642）

蛹虫草（Cordyceps militaris），属子囊菌门（Ascomycota）昆虫寄生真菌[1]，在我国被广泛用作民间医药或功能性食品[2]。蛹虫草子实体的活性成分含量高，如虫草多糖、总氨基酸、腺苷、虫草素等，因此常被用作冬虫夏草的替代品[3-4]。蛹虫草具有多种药理功能，如抗药性、炎症、抑制肿瘤和癌细胞生长[5]、增强动物和人的免疫力[6]、抗衰老、抗氧化[7-8]、抗凝血、降血糖[9-10]等。

在传统人工培养过程中，光照被用于刺激蛹虫草原基的形成和子实体的分化[11-12]。在固体培养基发酵培养条件下，当暴露于充足光照下，菌丝的颜色将从白色变为黄色[13-14]。随着光照培养的继续进行，蛹虫草子实体继续分化，虫草色素持续积累[15-16]。在光合作用植物、藻类和大型真菌的生长过程中，各种色素在协调生物体的正常发育和生长方面发挥着各种作用[17]。如叶绿素吸收光能并将其转化为化学能，为细胞生长提供能量[18]；类胡萝卜素淬灭由光产生的氧自由基并保护细胞组织[19-20]。因此，为了研究蛹虫草黄色素在蛹虫草发育过程中的重要作用，必须先对蛹虫草黄色素的种类进行鉴定及归类。

付鸣佳[21]在蛹虫草中发现类胡萝卜素。有研究在蛹虫草中发现了玉米黄素[22]和叶黄素[23]，并成功鉴定出4 种新型的水溶性北虫草黄素[24]。除了蛹虫草黄色素，多种虫草属真菌也都各具有色素。在双棱孢虫草（Cordyceps bifusispora）中发现一种新型黄色素[25]，从冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）的发酵液中分离出黑色素[26]，单侧虫草（Cordyceps unilateralis BCC 1869）中发现了萘醌[27]。

本实验通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法对蛹虫草黄色素进行分离纯化，并结合质谱法、紫外-可见光谱法、傅里叶变换红外（Fourier transform infrared，FTIR）光谱法对纯化素色进行结构鉴定。同时，采用响应面法对蛹虫草黄色素提取工艺进行优化，为其日后的生产和综合开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草（C. militaris CM 19）保藏于华南农业大学食品学院生物炼制实验室；CM 19子实体购买自广东省江门市鸿豪生物科技有限公司。

甲酸、乙腈均为色谱纯，其他提取用有机溶剂均为分析纯，购自成硕化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

An UV2310II紫外分光光度计 中国杭州奥盛仪器有限公司；RV8旋转蒸发仪 德国IKA公司；FD-1D-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；Synapt G2-Si液相色谱-质谱联用仪 美国Waters公司；LC-2030 HPLC仪 日本岛津公司；Vertex 70 FTIR光谱仪德国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹虫草新型黄色素种类鉴定

1.3.1.1 提取溶剂的确定

蛹虫草子实体经冷冻干燥、粉碎、过60 目筛备用。取子实体粉末1.0 g，加入20.0 mL不同溶剂（丙酮、乙醚、石油醚、水、甲醇、乙醇、50%甲醇和50%乙醇），充分振荡2 min，室温浸提30 min，8 000×g离心10 min，取上清液观察。

1.3.1.2 黄色素提取液的分离纯化

样品的制备：取1.3.1.1节中50%乙醇提取液，过0.22 μm微孔滤膜后，供HPLC分析。

HPLC检测条件：GL Inertsil C18ODS-SP色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温40 ℃，流速1 mL/min，进样量20 μL。洗脱程序为：A相为0.1%甲酸溶液，B相为0.1%甲酸-乙腈溶液（0 min， 45% B；1 min，45% B；8 min，48% B；9 min，45% B；14.21 min，停止）。采用二极管阵列检测器（diode array detector，DAD），检测波长为449 nm。在此基础上，利用制备型HPLC对各峰进行收集。

1.3.1.3 纯化色素的HRMS与FTIR分析

高分辨质谱（high resolution mass spectrometry，HRMS）检测条件：电喷雾离子源，负离子模式；DAD检测波长200～800 nm，干燥气温度350 ℃；干燥气流速750 L/h；毛细管电压2.5 kV；质量扫描范围m/z 100～1 000。

FTIR检测条件：采用溴化钾压片法，按照1∶100的比例加入纯化黄色素样品和溴化钾，研磨均匀后压片，在500～4 000 cm-1范围内测定红外光谱。

1.3.2 纯化黄色素标准曲线的绘制及提取量的计算

标准溶液的制备：取5.0 mg纯化色素，加入1.0 mL二甲基亚砜，充分溶解后过0.22 μm微孔滤膜，再用色谱纯乙腈稀释成不同质量浓度（0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL），以1.3.1.2节方法进行HPLC分析，得到标准曲线Y=80 411X-3 830.9，R2=0.999 4。Y为纯化色素峰积分面积，X为纯化色素质量浓度（μg/mL）。蛹虫草纯化色素提取量按下式计算：

式中：m0为用标准曲线测定得到的纯化色素质量/μg；M0为蛹虫草子实体质量/g。

1.3.3 单因素试验

分别以甲醇、乙醇溶液体积分数（0%、20%、40%、60%、80%、100%）、提取温度（4、16、25、40、50、60、70、80 ℃）、料液比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL））、提取时间（15、30、45、60、90、120、160 min）为影响因素进行单因素试验，考察各因素对纯化色素提取量的影响。

1.3.4 响应面试验设计

以纯化色素提取量为响应值，根据单因素试验结果，采用Box-Behnken试验设计原理，选择乙醇溶液体积分数、提取温度和提取时间3 个因素，共17 个试验点的响应面分析试验，确定最佳提取工艺。每一变量的低、中、高水平分别以-1、0、1编码，试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of factors used in Box-Behnken design

1.4 数据处理

采用Design-Expert V8.0.6软件进行响应面Box-Behnken试验设计，采用GraphPad Prism 7软件对数据进行整理统计分析，各项指标结果以表示（n=6），采用Tukey’s Multiple Comparison Test进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的比较

图1 不同提取溶剂的比较Fig. 1 Comparison of extraction efficiencies of yellow pigment with different solvents

如图1所示，蛹虫草黄色素能较好地溶解于水（图1H）、甲醇（图1E）溶剂，以及水分别与甲醇、乙醇的混合液（图1G、1F）。其微溶于乙醇（图1D）、丙酮（图1C）溶剂，在乙醚（图1B）、石油醚（图1A）中溶解性极差，说明水等强极性溶剂的提取效果明显优于石油醚等弱极性有机溶剂。根据相似相溶原理，说明蛹虫草黄色素是一类极性较大的化合物[28]。

2.2 HPLC、HRMS分析结果

为了进一步了解从蛹虫草中获得的色素种类，采用HPLC分离纯化蛹虫草粗提物，结果显示蛹虫草黄色素有9 个主要峰（图2A），各峰的分离度均大于1.5，说明通过反相C18柱可以实现蛹虫草黄色素的有效分离。同时，对第5号峰（保留时间为5.562 min）进行HRMS与全波长扫描测试，结果表明，纯化色素5准分子离子峰为m/z262.108 6 [M-H]-（图2B），并推测其分子式为C14H17N1O4。全波长扫描结果显示，纯化色素5在278、449 nm和477 nm波长处检测到最大吸收波长（图2C），表明该色素具有与类胡萝卜素结构相似的不饱和共轭体系[29]。

图2 HPLC、HRMS谱图Fig. 2 HPLC chromatogram and HRMS spectra

2.3 FTIR分析结果

图3 纯化色素5 FTIR光谱图Fig. 3 FTIR spectra of purified pigment 5

如图3所示，纯化色素5在3 384 cm-1处产生吸收，结合MS结果，氮规则表明该化合物有奇数个N原子存在，故推测此处为仲胺（R—N—H）伸缩振动。样品在3 303 cm-1处有强的宽带（R—O—H伸缩）振动吸收，并且在1 078、1 145 cm-1和1 175 cm-1处有较强的（C—O单键）振动吸收，在1 695 cm-1和1 565 cm-1处产生强的（C＝C）伸缩振动，在876 cm-1处产生（C—H）面外扭摆振动吸收，表明纯化色素5具有与类胡萝卜素相似的红外吸收特征[30]。同时，根据纯化色素5具有不饱和共轭多烯结构的特点，将该色素命名为虫草烯。

为了最终确定虫草烯的分子结构和立体结构，需结合核磁共振波谱法和单晶衍射技术对虫草烯进一步分析。同时，鉴于虫草烯具有与类胡萝卜素相似的紫外、红外吸收特征，虫草烯在抗氧化、抗衰老方面的药用价值也值得进一步研究。

2.4 单因素试验结果

2.4.1 甲醇、乙醇溶液体积分数对虫草烯提取量的影响

图4 甲醇、乙醇溶液体积分数对虫草烯提取量的影响Fig. 4 Effects of methanol and ethanol concentration on the extraction efficiency of cordycepene

在提取温度25 ℃、料液比1∶20、提取时间30 min条件下，测定不同体积分数甲醇和乙醇溶液对虫草烯提取量的影响。由图4可知，当甲醇、乙醇溶液体积分数为60%，虫草烯提取量最大，分别为（903.13±42.21）μg/g和（1 145.04±59.13）μg/g。再增加体积分数时，由于子实体粉末中脂溶性物质的溶出增加，从未减少虫草烯的溶解，提取量呈现下降趋势[31]。同时，由于甲醇具有一定毒性，不适宜应用于食品工业生产，所以选择60%乙醇溶液作为最佳提取溶剂。

2.4.2 提取温度对虫草烯提取量的影响

图5 提取温度对虫草烯提取量的影响Fig. 5 Effect of extraction temperatures on the extraction efficiency of cordycepene

在提取溶剂60%乙醇溶液、料液比1∶20、提取时间30 min条件下，测定不同提取温度对虫草烯提取量的影响。由图5可知，在较低温度范围内，随着提取温度的升高，增加了水分子的动能，促进了扩散运动的进

行[32]，虫草烯提取量不断增加，在40 ℃时提取量达到最大值（1 277.15±57.78） μg/g。超过40 ℃后，高温破坏虫草烯的结构稳定性，导致虫草烯碳链分解，失去原有的光学性质，虫草烯提取量呈现较快的下降。因此，在单因素优化试验过程中，始终保持提取环节在40 ℃以下的工作环境中进行。

2.4.3 料液比对虫草烯提取量的影响

图6 料液比对虫草烯提取量的影响Fig. 6 Effect of solid to solvent ratio on the extraction efficiency of cordycepene

在提取溶剂60%乙醇溶液、提取温度40 ℃、提取时间30 min条件下，测定不同料液比对虫草烯提取量的影响。由图6可知，虫草烯提取量随料液比的增加，呈现先增加后稳定的趋势。当料液比为1∶20时，提取量达到（1 489.71±50.01）μg/g。这一现象符合质量传递原则，当提取溶剂使用量比较大时，较大的浓度差会促使传质推动力增加，使传质速率增大，从而提高提取量[33-34]。再增大料液比，提取量的增加不明显，表明溶剂已将有效成分基本溶出完全。同时，过大的料液比会造成溶剂和能源的浪费，不利于后期浓缩工作的进行。因此，选择1∶20作为最佳的料液比，继续进行优化实验。

2.4.4 提取时间对虫草烯提取量的影响

图7 提取时间对虫草烯提取量的影响Fig. 7 Effect of extraction time on the extraction efficiency of cordycepene

在提取溶剂60%乙醇溶液、提取温度40 ℃、料液比1∶20条件下，测定不同提取时间对虫草烯提取量的影响。由图7可知，随着提取时间的延长，虫草烯提取量不断增加，当时间超过45 min，提取量趋于降低。提取45 min时，提取溶剂中虫草烯提取量趋向饱和状态，提取量达到（1 915.95±65.98）μg/g，时间不再成为影响提取量的重要因素。但随着提取时间的延长，40 ℃乙醇容易混发，减少的乙醇导致提取量缓慢降低[35-36]。

2.5 响应面试验设计与结果

2.5.1 响应面试验结果与回归方程拟合

利用Design-Expert V8.0.6软件，对实验结果进行多项式回归分析，结果见表2。经拟合回归，得到综合得率Y对自变量A、B、C的回归方程Y=2 212.08-438.49A＋152.21B＋179.90C＋60.57AB-112.06AC＋5.91BC-967.37A2-248.90B2-317.68C2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Box-Behnken design in terms of coded values with response variable

2.5.2 响应面模型方差及可行度分析

表3 回归模型方差及可信度分析Table 3 Analysis of variance and reliability of regression model

由表3可知，此模型P值小于0.01，表明回归模型达到极显著水平。失拟项P=0.125 4＞0.05，模型失拟度不显著，模型相关系数R2为0.983 3，校正决定系数R2Adj为0.961 8表明此模型拟合优度好，实验误差小，可用该模型分析和预测各因素对蛹虫草虫草烯提取量的影响[37-38]。在一次项中，乙醇溶液体积分数、提取时间对蛹虫草虫草烯提取量的影响极显著；提取温度对虫草烯提取量的影响显著。各因素显著性程度依次为乙醇溶液体积分数＞提取时间＞提取温度。

2.5.3 交互作用分析结果

图8 各因素交互作用对虫草烯提取量影响的响应面图Fig. 8 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on cordycepene extraction

由图8可知，虫草烯提取量随着乙醇溶液体积分数、提取温度、提取时间的增大呈现先增大后减少的趋势，说明该模型具有极大值。响应面的陡峭程度随乙醇溶液体积分数、提取时间的变化起伏较大，说明乙醇溶液体积分数、提取时间对虫草烯提取量的影响大于提取温度。以上分析与表3的方差分析结论一致。

2.5.4 工艺参数优化验证结果

表4 提取次数对虫草烯提取率的影响Table 4 Effect of number of extraction cycles on the extraction yield of cordycepene

通过软件求解回归方程，最佳蛹虫草虫草烯提取条件为乙醇溶液体积分数57.68%、提取温度44.40 ℃、提取时间52.44 min，预测虫草烯提取量可达到2 299.61 μg/g。在此条件下，测定实际蛹虫草黄色素得率为（2 259.23±83.88）μg/g（表4），与预测值相近，偏差较小，证明了该方程的准确性和实用性。同时，在最佳提取条件下，进行多次提取，确定提取级数和虫草烯在子实体粉末中的最终含量。虫草烯提取量随着提取次数的增加而增大，当提取级数达到第7次时，HPLC已经检测不到虫草烯的存在，此时蛹虫草子实体中虫草烯提取量为（2 780.97±170.38）μg/g（表4）。当提取级数达到第3次时，虫草烯提取率已达到99.88%（表4），为了节省提取时间和减少提取溶剂的使用，故确定提取级数为3 级[39-40]。

3 结 论

本实验利用HPLC、质谱与FTIR相结合的方法，发现一种新型的蛹虫草黄色素，推测其分子结构式为C14H17N1O4。该色素具有与类胡萝卜素相似的紫外-可见光和红外吸收特征，表明该色素具有不饱和共轭多烯结构的特点，故将其命名为虫草烯。

响应面试验结果显示，各因素对虫草烯提取量的显著性程度依次为乙醇溶液体积分数＞提取时间＞提取温度，确定虫草烯最佳提取工艺条件为乙醇溶液体积分数57.68%、提取温度44.40 ℃、提取时间52.44 min，实际测定虫草烯提取量为（2 259.23±83.88）μg/g。提取级数确定为3 级，此时虫草烯提取率可达99.88%，含量为（2 777.72±170.46）μg/g（表4）。