Lactobacillus buchneri IMAU80233高密度发酵工艺优化

杨瑞冬，李伯海，王元弛，董安利，孙浩天，张和平*

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，农业部奶制品加工重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）

布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）属于异型发酵乳酸菌，形态为短杆状，菌落呈圆形，革兰氏染色呈阳性，无芽孢，无运动性[1]。通过黏附、竞争排斥、占位和产生抑制物等效应自然栖息在各类生态位[2]，广泛存在于乙醇生物生产厂、泡菜汁、人肠道和口腔、奶酪样本、青贮饲料和变质的发酵黄瓜中[3-7]。除拥有所有革兰氏阳性细菌典型的肽聚糖细胞壁，一些L. buchneri还具有额外的规则排列蛋白质表面保护层（S层）[8]，S层蛋白能够保护L. buchneri细胞免受噬菌体和化学物质侵害的同时参与细胞黏附并决定细胞形状[9]。

L. buchneri在许多食品与饲料发酵过程中起好坏参半的作用，既是腐败菌，又是有益发酵剂。L. buchneri作为腐败菌可导致发酵黄瓜变质[7]；L. buchner具有降胆固醇、调节宿主肠道菌群、抑制腐败菌等功能[10-13]；可降低奶牛子宫内膜炎感染率改善奶牛生殖性能[14]；在酸面团中生产丙酸盐，延长产品保质期[15]；对乙醇具有高度耐受性，已被开发用于乙醇生物生产厂[16]；L. buchneri常被用作青贮饲料接种剂，可显著提高有氧稳定性、降低干物质损失率[17-20]。随着菌株身份确立且未检测出抗生素耐药性，对喂食动物及其消费者和外界环境都安全，已基本被食品行业接受。

L. buchneriIMAU80233是由20 株不同分离源L. buchneri经耐酸耐胆盐、生长特性实验筛选而得到的1 株具有潜在益生特性的菌株。本研究对L. buchneriIMAU80233培养基和培养工艺进行优化，实现菌体高密度培养，为规模化生产提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L. buchneriIMAU80233分离自四川省阿坝州诺尔盖县鲜牦牛奶，由内蒙古农业大学乳品与生物技术教育部重点实验室乳酸菌菌种库（LABCC）保藏，GenBank序列号HM058519。

所用试剂部分为分析纯，其中高密度发酵研究部分采用工业级试剂，均由内蒙古农业大学乳品生物与技术教育部重点实验室提供。

1.2 仪器与设备

5810R型台式高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司；EYELA WFO-700型干燥箱 东京理化器械株式会社；VS-1300L-U洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；U-2000型分光光度计 株式会社日立制作社；FE20型pH计 瑞士梅特勒-托利多集团；DHP-9272型恒温培养箱、HWS28型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；SIM-F124制冰机 日本三洋电机株式会社；ADVANTEC SP-650型全自动干热灭菌器 广州绿百草科学仪器有限公司；SX-500型高压蒸汽灭菌锅 日本TOMY生物仪器公司；5 L液体发酵罐GUJS-5及其附属设备镇江东方电热科技有限公司；BX50型光学显微镜日本奥林巴斯株式会社；KDC-6000R低速冷冻离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司；LL-6SFPV型真空冷冻干燥机 美国Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

L. buchneriIMAU80233菌种冷冻保存于脱脂乳冻存管中（-80 ℃），每次实验前将菌种以体积分数2%接种量接种于液体MRS培养基中，37 ℃厌氧培养48 h，活化2 代。

1.3.2 培养基成分筛选

采用Bioscreen C全自动生长读值系统对L. buchneriIMAU80233生长最适碳氮源进行快速筛选：以不同种类碳氮源分别替代MRS培养基碳源，保持培养基其余成分及比例不变配制新的培养基；在上述优化实验的基础上分别加入不同类别缓冲盐体系、微量元素和促生长因子等物质，采用Bioscreen C全自动生长读值系统快速筛选促进L. buchneriIMAU80233生长的物质。

1.3.3 Bioscreen C系统参数

Bioscreen C读值系统是一个全自动化的仪器，该系统包括阅读器（包含1 个培养箱和1 个测量单位）、样品盘和软件，能够长时间记录菌体密度（吸光度A）。设置培养温度37 ℃、培养时间48 h，每2 h读取一次菌体密度A值，A值读取波长为600 nm，读值前后样品盘振荡60 s与25 s，振荡速度一般。每个加样孔内依次加入270 μL培养基、30 μL活化2 代菌液与50 μL无菌石蜡，每组设置3 个平行，将样品板放入Bioscreen C培养箱内37 ℃培养48 h，根据菌株生长情况确定最适生长物质。

1.3.4 培养基主要成分响应面优化

根据以上实验优化结果，对L. buchneriIMAU80233培养基碳源、氮源、缓冲盐体系进行Box-Behnken试验设计（表1），以菌体密度为响应值，确定培养基中主要成分的最优配比。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Coded levels for independent variables used in Box-Behnken design

1.3.5 高密度发酵条件优化

采用5 L×3联液体发酵罐对L. buchneriIMAU80233高密度发酵恒定pH值、气体环境等关键条件进行单因素优化。以发酵终点发酵液活菌数和菌体密度为指标；发酵过程中流加25%氨水保持培养基恒定pH 6.50±0.02，培养温度37 ℃，搅拌速率150 r/min，罐压0.03～0.04 MPa。

1.3.6 菌体生长特性检测

菌体密度测定：用紫外分光光度计在600 nm波长处测定L. buchneriIMAU80233的吸光度。测定前先用蒸馏水调零紫外分光光度计，以蒸馏水为空白。

活菌数测定：L. buchneriIMAU80233发酵液用无菌磷酸盐缓冲液进行10 倍系列梯度稀释，至适宜梯度后取1 mL稀释液加入培养皿，采用倾注法计活菌数，培养基为改良MRS琼脂（以等量果糖替代葡萄糖）。培养皿于37 ℃厌氧48 h后统计结果。

pH值测定：利用pH计，每次测定前先将pH计校准。

发酵终点判定：发酵至加碱高峰期后，每隔1 h测定发酵液菌体密度A600nm，差异不显著则终止发酵。

1.4 数据处理

响应面试验采用Design-Expert软件进行设计与分析，差异性分析采用SPSS 17.0，图形绘制采用Origin 2017软件。

生长曲线拟合与生长参数估计采用Logistic方程进行拟合：

式中：x为培养时间/h；y为菌体密度；y0为初始菌体密度；a为菌体密度最大值；µmax为最大比生长速率/h-1。

2 结果与分析

2.1 培养基成分筛选

2.1.1 碳源和氮源的筛选

碳水化合物是乳酸菌除水之外生长需求量最大的物质；氮源在乳酸菌生长过程中起着重要的作用，不同种类的乳酸菌蛋白水解酶系存在差异，导致最适生长氮源种类不同[21]。选择适合L. buchneriIMAU80233生长的碳氮源尤为重要，本着工业生产成本最低化原则，综合本实验室发酵乳酸菌常用到的碳氮源，筛选促L. buchneriIMAU80233生长最适碳氮源，结果见表2。

表2 L. buchneri IMAU80233在不同碳氮源培养基中的最大比生长速率（x ±s，n=3）Table 2 Maximum speci fic growth rates of L. buchneri IMAU80233 grown with different carbon and nitrogen sources (x± s, n= 3)

由表2可知，L. buchneriIMAU80233在以果糖为碳源的培养基内最大比生长速率值最高为0.159 5 h-1，与低聚异麦芽糖实验组0.145 1 h-1无显著差异（P＞0.05），二者与其余各组存在显著差异（P＜0.05）。其次，蔗糖与可溶性大豆多糖实验组最大比生长速率分别为0.065 9 h-1和0.052 5 h-1，其中葡萄糖（MRS）实验组最大比生长速率最低为0.005 3 h-1，与其余各组存在显著差异（P＜0.05）。以上结果表明在以低聚果糖、水苏糖和葡萄糖为碳源的培养基内几乎不生长，在以棉籽糖、海藻糖为碳源的培养基内生长缓慢，在以果糖与低聚异麦芽糖为碳源的培养基内生长最快。冯晨龙等[22]在L. parabuchneriK1培养基内加入300 g/L果糖驯化得到耐高渗菌株L. parabuchneriK2，果糖利用速率提高了103%，发酵周期缩短46.4%。综合考虑工业生产成本选择果糖作为碳源进行下一步研究。

酵母粉实验组最大比生长速率0.101 1 h-1，大豆蛋白胨实验组最大比生长速率0.096 8 h-1，二者之间差异不显著（P＞0.05），显著高于其他实验组（P＜0.05）。其次，酵母蛋白胨和鱼蛋白胨实验组最大比生长速率分别为0.071 6 h-1和0.070 5 h-1。结果表明，L. buchneriIMAU80233在以酵母粉和大豆蛋白胨为单一氮源时生长情况要明显优于其他实验组。由于酵母粉和大豆蛋白胨实验组不存在显著性差异（P＞0.05），故对其复配进一步优化，结果见表3。

表3 不同氮源复配比对L. buchneri IMAU80233菌体密度的影响（x ±s，n=3）Table 3 Effect of nitrogen source composition on the cell density of L. buchneri IMAU80233 (x± s, n= 3)

由表3可知，以酵母粉和大豆蛋白胨为L. buchneriIMAU80233生长氮源进行不同比例复配时，酵母粉和大豆蛋白胨以1∶2比例复配菌体密度达到最高值4.35，显著高于其他实验组（P＜0.05）。随着大豆蛋白胨含量的增加，菌体密度呈现出先上升后下降的趋势；随着酵母粉含量的增加，菌体密度呈现先上升后下降趋势。MRS实验组菌体密度为2.84，显著低于其他实验组（P＜0.05）。酵母粉实验组和大豆蛋白胨实验组菌体密度分别为3.24与3.18，显著低于处理组1、2、4（P＜0.05），可见复配实验的必要性。综上所述，选择酵母粉与大豆蛋白胨比例为1∶2进行下一步研究。常峰等[23]在研究L. buchneri YCF10发酵条件时，同样在培养基内添加0.5%酵母粉和1%大豆蛋白胨作为最佳氮源。

2.1.2 培养基碳氮源总量及比例优化

培养基内碳氮源总量及比例的变化显著影响着菌体生长[24]。以上述实验为基础，选取碳氮源总量40～80 g/L，碳氮比为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1和3∶1。

图1 碳氮总量及比例对L. buchneri IMAU80233菌体密度的影响Fig. 1 Effects of total concentration of nitrogen and carbon and carbon/nitrogen ratio on the cell density of L. buchneri IMAU80233

由图1可知，L. buchneri IMAU80233菌体密度随着培养基内碳氮源总量增加而增加；当培养基内碳氮源总量一定时随着碳源比例的升高，菌体密度都呈现出先上升后下降趋势；培养基不同碳氮源总量在碳氮比为2∶1时达到菌体密度最高值，故选择碳氮总量为80 g/L，碳氮比为2∶1进行下一步研究。

2.1.3 培养基缓冲盐体系优化

乳酸菌在培养基内生长过程中会产生乳酸等酸性物质导致培养基pH值下降，抑制自身进一步增殖[25]。缓冲盐能够在一定程度上维持培养基内pH值相对稳定，同时能够调节菌体细胞周围渗透压平衡，提高菌体生长量[26]。采用Bioscreen C读值系统对pH 6.0的7 种缓冲体系进行分析，结果如图2所示。

图2 培养基中不同缓冲盐对L. buchneri IMAU80233最大比生长速率的影响Fig. 2 Effects of different buffer salts on the maximum specific growth rate of L. buchneri IMAU80233

由图2可知，Na2HPO4·12H2O/NaH2PO4·2H2O与MRS缓冲体系相比存在显著性差异（P＜0.05），能够在一定程度上促进L. buchneri IMAU80233菌体增殖；柠檬酸-柠檬酸钠实验组最大比生长速率显著高于其他实验组（P＜0.05），表明柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系能够显著提高L. buchneri IMAU80233菌体密度；其他组与MRS对照组最大比生长速率不存在显著性差异（P＞0.05），表明其不能促进L. buchneri IMAU80233增殖。故选择柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系进行下一步研究。

2.1.4 培养基微量元素优化

微量元素通常作为某些活性物质的组成成分或者酶的激活剂发挥作用[27]。采用Bioscreen C读值系统对添加不同量ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和MnSO4·5H2O的培养基进行优化。

图3 培养基中不同微量元素对L. buchneri IMAU80233最大比生长速率的影响Fig. 3 Effects of different trace elements on the maximum specific growth rate of L. buchneri IMAU80233

由图3可看出，与空白组（虚线）相比，随着ZnSO4·7H2O添加量上升，菌体最大比生长速率呈现下降趋势，不同添加量的CuSO4·5H2O与FeSO4·7H2O最大比生长速率也呈现出相似的趋势，表明ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O与FeSO4·7H2O对L. buchneriIMAU80233生长增殖具有一定抑制作用；不同添加量的MnSO4·5H2O对菌体最大比生长速率提高效果明显，与空白组相比存在极显著差异（P＜0.01）；此外MgSO4·7H2O对L. buchneriIMAU80233菌体最大比生长速率促进效果明显，存在显著差异（P＜0.05），因此优化培养基选择加入90 mg/L MnSO4·5H2O和600 mg/L MgSO4·7H2O。李兴峰[28]的研究结论与本实验结果相符，Mg2＋和Mn2＋对乳杆菌酶活力有促进作用，Cu2＋对乳杆菌酶活力有不同程度的抑制作用。

2.1.5 培养基生长因子优化

乳酸菌属于生长因子异养型微生物，在培养基中添加一些乳酸菌自身难以合成却是调节生长或代谢不可缺少的物质可促进其生长[29]。采用Bioscreen C读值系统对不同种类和浓度生长因子进行筛选，由图4可看出，添加不同种核苷酸和维生素对L. buchneriIMAU80233菌体最大比生长速率并无明显促进效果。精氨酸实验组对L. buchneriIMAU80233菌体最大比生长速率促进效果要优于其他氨基酸，且与空白组相比存在显著性差异（P＜0.05）。Liu等[30]在研究代谢途径时发现培养基内加入精氨酸和可发酵糖会促进L. buchneri菌体生长。综和考虑工业化生产成本，静态发酵培养基中添加500 mg/L精氨酸，工业生产中不作考虑。

图4 培养基中不同生长因子对L. buchneri IMAU80233最大比生长速率影响Fig. 4 Effects of different growth factors on the maximum specific growth rate of L. buchneri IMAU80233

2.1.6 培养基主要成分响应面优化

采用Design-Expert软件中Box-Behnken设计法对培养基主成分碳源、氮源和缓冲盐用量进行优化，以菌体密度（A600nm）为响应值，设计3因素3水平共17 组响应面试验。用来评估误差的零点试验重复5 次，试验设计与结果见表4。

表4 Box-Behnken试验设计及结果Table 4 Box-Behnken design with experimental results

采用Design-Expert软件对试验结果进行分析，得到L. buchneriIMAU80233菌体密度与培养基3 类主成分生长模型为：Y=8.17＋0.10X1＋1.49X2-0.11X3＋0.055X1X2-

采用Design-Expert软件对响应值进行显著性回归分析，二次项对L. buchneriIMAU80233菌体密度有显著影响（P＜0.05），交叉项对L. buchneriI MAU8 02 33菌体密度影响有一定影响但不显著（P＞0.05），方程模型整体极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），方程模型的为0.926 0，为0.830 9，说明方程与试验拟合度良好[31]。

图5 碳源、氮源、缓冲盐用量交互影响的响应面图Fig. 5 Response surface plots showing the interactive effect of buffered salt, carbon and nitrogen on the cell density of L. buchneri IMAU80233

由图5可知，随着碳源、缓冲盐用量增加，菌体密度呈现先增加后下降的趋势。菌体密度最大值出现在曲面上，且碳源、缓冲盐各自对应菌体密度最大值与其并不重合，可知二者之间存在显著性差异（P＜0.05）。随着氮源用量增加，菌体密度先增加，后趋于平衡。回归分析结果表明碳源与氮源、缓冲盐与氮源之间交互作用不显著（P＞0.05）。

响应面预测最优培养基为碳源50.78 g/L、氮源35.8 g/L、缓冲盐21.65 g/L，菌体密度预测最大值为8.704，为验证该方法可靠性，采用上述优化后培养基对L. buchneri IMAU80233活化二代按2%接种量37 ℃厌氧培养24 h，菌体密度为8.853，与模型预测最优值不存在显著差异（P＞0.05），表明此方法结果可靠。最终优化后静态培养基成分为果糖50.78 g/L，大豆蛋白胨23.90 g/L，酵母粉11.90 g/L，柠檬酸1.59 g/L，柠檬酸钠20.06 g/L，MnSO4·5H2O 0.09 g/L，MgSO4·7H2O 0.60 g/L，精氨酸0.50 g/L，吐温-80 1.00 g/L。

2.2 高密度培养工艺优化

2.2.1 培养基碳源用量优化

L. buchneri属于典型的异型发酵乳酸菌，在发酵过程中代谢碳源可产生乳酸、乙醇、乙酸、CO2等多种物质[32]。同时考虑到2.1.2节结果显示碳氮比在2∶1时菌体密度最高，因此高密度发酵实验中增加果糖用量，以期达到更高活菌数，结果见图6。

图6 果糖用量对发酵液活菌数影响Fig. 6 Effect of fructose concentration on the viable cell count of fermentation broth

由图6可以看出，当果糖用量为60～120 g/L时，发酵液中L. buchneri IMAU80233活菌数呈现先增加后下降的趋势，在果糖用量为80 g/L时活菌数达到最高。结果表明适当提高果糖用量可以提高L. buchneri IMAU80233发酵液中活菌数，果糖用量太高可能抑制L. buchneri IMAU80233生长增殖，因此选择高密度发酵培养基果糖用量为80 g/L。

2.2.2 高密度培养条件优化

乳酸菌生长是否良好取决于适合的培养基和培养条件。其中最为首要的因素包括培养温度（L. buchneri最适培养温度为37 ℃[33]，此处不做优化）、恒定pH值、气体环境等。高密度培养过程中发酵液恒定pH值对菌体活菌数、离心得率、冻干菌粉后期稳定性与溶解性和发酵用时等有着关键性作用。L. buchneri IMAU80233属于兼性厌氧菌，发酵初期气体环境对L. buchneri IMAU80233启动起至关重要的影响。为实现工业生产利益最大化，本研究利用5 L×3联发酵罐对L. buchneri IMAU80233高密度发酵过程中恒定pH值和气体环境进行优化。

图7 发酵恒定pH值和气体环境对L. buchneri IMAU80233菌体密度和活菌数的影响Fig. 7 Effect of constant fermentation pH value and gas environment on the cell density and viable count of L. buchneri IMAU80233

如图7所示，当恒定pH值为5.9时，活菌数和菌体密度显著高于其他2 个实验组（P＜0.05）；同一指标不同气体环境L. buchneri IMAU80233活菌数差异显著（P＜0.05），发酵初期通入氮气实验组优于空气实验组。综上所述，发酵初期选择通入氮气、恒定pH值5.9发酵，优化后活菌数达3.81×109CFU/mL。

3 结论与讨论

本研究以工业化生产为出发点，对具有潜在益生特性菌株L. buchneri IMAU80233高密度培养基配方和培养工艺进行优化。确定高密度培养基为果糖80 g/L，大豆蛋白胨23.90 g/L，酵母粉11.90 g/L，柠檬酸1.59 g/L，柠檬酸钠20.06 g/L，MnSO4·5H2O 0.09 g/L，MgSO4·7H2O 0.60 g/L，吐温-80 1.00 g/L；确定高密度培养条件为：初始pH 6.5、流加25%氨水恒定pH 5.9、37 ℃恒温至发酵20 h至发酵终点。优化后发酵液活菌数为3.81×109CFU/mL。本研究在提高潜在益生特性L. buchneri IMAU80233发酵液活菌数的同时还大幅度缩短其发酵时间，对其工业化应用和微生态制品生产都将有深远意义。

利用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪绘制L. buchneri IMAU80233在各类生长物质中的生长曲线，以最大比生长速率为指标实现最优生长物质快速筛选。该仪器存在一定的局限性：无法对点样孔内样品进行自动稀释，所以很难准确测定菌体密度大于2对应各点的信息，实验过程中采取减少接种量或稀释培养基的方法来延缓菌体生长，可在一定程度上规避此局限性。本研究方法优点在于通量高，能够一次性对几十种不同种类生长物质进行筛选比较[34]，且实验周期短，数据平行，能够在一定程度上反映菌体特性，适合应用于此类研究中。