不同蛋白酶制备鹅肉呈味肽的对比分析

唐 霄，孙杨赢*，江雪婷，潘道东，郑兰亭，曹锦轩

（宁波大学 浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江 宁波 315800）

鹅肉是人们喜爱的禽肉之一，具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点，备受人们青睐，其营养丰富均衡、氨基酸组成合理，是制备呈味肽的理想优质蛋白原料。呈味肽是增强食品原有风味的肽类物质，包括酸、苦、甜、鲜和咸味[1-2]，由于其安全性高、吸收性强的特点，在食品加工工业中逐渐得到应用。苗晓丹等[3]采用中性蛋白酶制备河豚呈味肽，所得酶解液鲜味突出，较好地保留了暗纹东方鲀肉汤浓厚、持久的感觉。陶正清等[4]对盐水鸭水提物中的小分子肽进行了分离纯化和结构鉴定，发现了3 条可能产生鲜味、甜味和浓厚感呈味肽，对盐水鸭的滋味有一定的贡献。李静等[5]利用低值虾制备呈味肽，研究了复合蛋白酶的酶解工艺，在最佳条件下，短肽（360～1 000 Da）得率达到42.93%，且风味良好。而目前鹅肉的研究主要集中在具有生理活性的抗氧化肽生产、水解工艺的优化等[6-7]，利用鹅肉制备呈味肽的研究较少。

蛋白质酶水解有助于改善食品的营养价值和功能特性，陈怡颖等[8]对比分析了酶解液与鸡汤中游离氨基酸的组成及含量，发现酶解液中的游离氨基酸总含量相对鸡汤显著增加。中性蛋白酶是一类在中性条件下作用于蛋白质肽键的蛋白酶，其作用条件温和、水解度高、风味佳，已广泛用于生产高级调味品和食品营养强化剂，各种动物来源性抽提物生产功能性骨、水产提取物、肽等及研究开发一些高附加值的功能食品[9]，碱性蛋白酶是一类最适作用pH值为碱性的蛋白酶，可水解肽键、酯键、酰胺键，在食品行业可水解动植物蛋白[10]。风味蛋白酶为由米曲霉发酵产生的具备活性的酶，它能用于食品风味的改良[11]。此外，木瓜蛋白酶对许多蛋白质都有水解作用，具备酶活性高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，是一种广泛应用的商业酶[12]。这4 种酶在食品风味及品质调节方面发挥着重要的作用。

本研究以鹅肉为原料，选用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶，以水解度、寡肽质量分数、感官评定和游离氨基酸的变化为依据，通过电子舌进一步确定呈味作用，研究不同种类的蛋白酶对鹅肉酶解制备呈味肽的影响，以期选出在相应条件下最适宜制备呈味肽的蛋白酶，对鹅肉滋味研究系统进行完善，为开发富含呈味肽的营养功能型鹅肉调味料提供重要的理论基础，为推动鹅肉精深加工产业的发展，实现鹅肉加工副产物的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10 只冷冻鹅分2 批次购自宁波清水浦市场，将其放入装有冰袋的箱子，0.5 h内运回实验室进行解冻。

中性蛋白酶（5×104U/g）、碱性蛋白酶（2×105U/g）、风味蛋白酶（15×106U/g）、木瓜蛋白酶（1×105U/g）（均为食品级） 北京索莱宝科技有限公司；盐酸、氢氧化钠、柠檬酸均为国产分析纯；茚三酮、氨基酸分析用缓冲液（均为色谱纯） 百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

WJWX-A500型高速多功能粉碎机 上海缘沃工贸有限公司；XHF-D高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；KDN-16C数显温控消化炉 上海新嘉电子有限公司；Centrifuge 5804R离心机 艾本德中国有限公司；Smartongue电子舌 上海瑞玢国际贸易有限公司；Infinite 200 Pro全波长扫描多功能酶标仪 瑞士Tecan公司；L-3000型全自动氨基酸分析仪 苏州华美辰仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

将冷冻鹅肉装于保鲜袋后浸泡在4 ℃水中进行解冻，解冻完毕后用大量清水洗净，剔除所有鹅骨、鹅肉表面脂肪，将鹅肉剪成0.5 cm×2 cm×2 cm的小块，用高速多功能粉碎机进行多次重复搅碎得到鹅肉糜，置于保鲜密封袋中放入-20 ℃冰箱冻藏备用，贮藏期限20 d内。

1.3.2 鹅肉蛋白酶解液的制备

称取经过预处理的鹅肉糜125 g置于500 mL的烧杯中，按固液比1∶3（g/mL）加水，冰浴匀浆（10 000 r/min，3×30 s），将匀浆好的鹅肉用1 mol/L的NaOH或HCl溶液调pH值至各蛋白酶的最适pH值，然后在恒温水浴锅中45 ℃预热15 min，加入蛋白酶，在45 ℃恒温酶解6.5 h，酶解完毕后于100 ℃水浴加热10 min进行灭酶，冷却到室温，4 500 r/min、4 ℃离心15 min，收集上清液备用。4 种蛋白酶酶解条件见表1。

表1 4 种蛋白酶酶解鹅肉条件Table 1 Conditions for hydrolysis of goose meat by four proteases

1.3.3 总氮含量的测定

采用凯氏定氮法[13]。

1.3.4 水解度的测定

采用甲醛电位滴定法测定上清液氨基态氮含量，采用甲醛电位滴定法测定上清液氨基态氮含量，凯氏定氮法测定总氮含量，按照下式计算水解度[14]：

式中：V1为滴定样品时消耗标准NaOH溶液体积/mL；V2为滴定空白时消耗标准NaOH溶液体积/mL；C为滴定时标准NaOH溶液浓度/（mol/L）；m为样品质量/g。

1.3.5 寡肽质量分数的测定

小分子肽含量采用三氯乙酸法[15]，量取10 mL酶解液，加入10 mL 20%三氯乙酸溶液，混合均匀，静置10 min。将样品溶液4 000 r/min离心10 min，测上清液总氮含量，用以表示酶解液中小分子肽含量。

1.3.6 氨基酸成分分析

1.3.6.1 氨基酸标准曲线绘制

精确称取氨基酸混合标样76.83 mg，用超纯水定容至100 mL，即得2.5 μmol/mL标准溶液。从中准确移取2 mL混合溶液，加入2 mL含有多种标准氨基酸组分（2.5 μmol/mL）的混合液，用超纯水定容至50 mL，即为0.10 μmol/mL混合标准溶液，于4 ℃冰箱保存，备用。

1.3.6.2 氨基酸分析程序与条件[16]

氨基酸自动分析仪参数条件：分离柱（4.6 mm×60 mm），树脂为阳离子交换树脂；分离柱温度57 ℃；检测波长570 nm（脯氨酸为440 nm）；进样量20 μL；缓冲液流速0.35 mL/min；反应液茚三酮试剂，流速0.35 mL/min；单元温度135 ℃；使用自带软件进行数据分析，样品中氨基酸含量以mg/100 g表示。

1.3.7 感官评价

感官评价小组由经过筛选和专业培训的年龄介于20～25 岁之间的10 名感官评价员所组成，4 名男性、6 名女性。评价员分别对按1∶7比例稀释过后，温度保持在35 ℃左右的4 种鹅肉酶解液进行评价，评分采取5 分制[17]，具体评分标准见表2。

表2 鹅肉酶解液的感官评分标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of goose meat hydrolysates

1.3.8 电子舌测定滋味轮廓

Smartongue电子舌系统，由6 根化学传感器阵列组成，能对酸味、咸味、鲜味等具有专一响应性。在测定4 种蛋白酶解液的滋味轮廓前，需对4 种酶解液进行稀释（用纯净水按1∶7比例），每个样品测定7 次。用NaCl（代表咸味）和谷氨酸钠（monosodium glutamate，MSG）（代表鲜味）分别配成质量浓度为0.1、0.2、0.3 mg/mL的标准梯度溶液（0.1 mg/mL MSG、0.2 mg/mL MSG、0.3 mg/mL MSG、0.1 mg/mL NaCl、0.2 mg/mL NaCl、0.3 mg/mL NaCl）。此外，分别用0.1、0.2、0.3 mg/mL NaCl和0.1、0.2、0.3 mg/mL MSG配成对应的混合液（0.1 mg/mL（MSG＋NaCl）、0.2 mg/mL（MSG＋NaCl）、0.3 mg/mL（MSG＋NaCl））作为参照的标准梯度溶液[18]，测量前对电子舌进行自检、活化、校准和诊断等步骤，以确保采集所得数据的可靠性和稳定性。

1.4 数据处理

数据采用SPSS 18.0进行相关数据的方差分析和显著性检验，每组实验数据重复测定3 次，采用Origin 8.0制图。电子舌采集数据根据系统自带软件AlphaSoft进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶种类对鹅肉酶解液的水解度、寡肽及氨基酸含量的影响

表3 不同鹅肉酶解液对应的水解度和寡肽含量Table 3 Hydrolysis degrees and oligopeptides content of different goose meat hydrolysates

如表3所示，木瓜蛋白酶酶解产物的水解度最大，为31.41%。其次是中性蛋白酶及碱性蛋白酶，而风味蛋白酶的水解效果最差，仅为7.97%。在相同的酶解条件下，不同蛋白酶对鹅肉蛋白酶解效果不同，这主要是由酶的专一性所决定，酶的专一性决定它只能作用于某些特定的位点，所以即使是同样的底物，不同酶的水解效果会有所不同[19]。此外，木瓜蛋白酶酶解液的水解度大可能与其内切酶特性和风味酶的外切酶特性有关，内切酶可以直接作用于蛋白质肽链的中间位点，而风味蛋白酶是外切酶，外切酶只有从蛋白质肽链的两端酶解，缺乏足够多的端点，风味酶酶解产物的水解度较低[20-21]。因此，在水解度中风味蛋白酶与其他酶差别大于寡肽和氨基酸部分。其他3 种酶制备鹅肉呈味肽的效果明显优于风味蛋白酶。

木瓜蛋白酶酶解液中寡肽质量分数最高，为0.22%，此蛋白酶的活性位点能与底物充分接触，使底物充分酶解。其次中性蛋白酶酶解液中寡肽质量分数较高，为0.18%，中性蛋白酶的酶解效果强于碱性蛋白酶和风味蛋白酶。在酶解过程中，鹅肉蛋白逐渐被水解为小分子肽及游离氨基酸[22]。因此，酶解液中寡肽质量分数也能反映蛋白酶水解效果的高低，含量高的酶解效果佳。酶解过程中产生的肽类物质对酶解液风味的影响，主要是部分寡肽与其他呈味物质发生协同作用，使酶解液风味饱满、口感协调。寡肽一般由2～6 个氨基酸组成，一般来说，寡肽质量分数高的酶解液，其呈味肽的含量也可能相应较高[23-24]。根据水解度和寡肽质量分数的差异，说明中性蛋白酶、木瓜蛋白酶制备鹅肉呈味肽的效果明显优于碱性蛋白酶和风味蛋白酶。

表4 4 种鹅肉酶解液中氨基酸组成Table 4 Free amino acid compositions of four goose meat hydrolysates mg/100 g

游离氨基酸具有呈味阈值低、呈味能力强的特点，同时富有酸、甜、苦、咸、鲜5 种基本味感，其含量和种类会直接影响体系的整体风味[25]。由表4可知，鹅肉酶解液中游离氨基酸种类及含量丰富。中性蛋白酶酶解液中游离氨基酸总量最高为1 287 mg/100 g，其次是碱性蛋白酶酶解液和木瓜蛋白酶，分别为1 018、930 mg/100 g，而风味蛋白酶酶解液中游离氨基酸总量最低为489 mg/100 g，其酶的水解能力最差。总的来说，制备所得酶解液中的游离氨基酸能赋予食物特定的味感，为Maillard反应制备热反应型肉味香精提供底物[26-27]。

经不同蛋白酶酶解后，4 种酶解液中游离氨基酸含量最高的为亮氨酸，其中碱性蛋白酶酶解液中的苯丙氨酸和亮氨酸含量相同，为140 mg/100 g，它们均为苦味氨基酸。Lioe等[28]研究发现苦味氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸，其含量低于呈味阈值时可增强其他氨基酸的鲜味和甜味。酶解液中对鲜味和甜味有重要作用的氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和脯氨酸总量很高，其中谷氨酸和天冬氨酸是主要的鲜味氨基酸，具有形成肉鲜味和缓冲咸味等味道的特殊功效[29-30]，而甘氨酸除本身提供的清香甜味外，还能减少苦味，从食物中除去不愉快的口味[31]。鹅肉酶解液中鲜甜呈味氨基酸含量分别为中性蛋白酶（377 mg/100 g）＞碱性蛋白酶（2 9 8 m g/1 0 0 g）＞木瓜蛋白酶（256 mg/100 g）＞风味蛋白酶（197 mg/100 g），占氨基酸总量的比例分别为29.29%、29.27%、27.53%和40.29%。由此可见，酶解液中均含有鲜甜味氨基酸，而风味蛋白酶酶解液中鲜甜呈味氨基酸的质量分数最高。其他氨基酸如蛋氨酸，它作为含硫氨基酸虽然本身不会产生肉香，但对酶解液风味的形成有重要的作用，其含量也在中性蛋白酶中最大，是熟肉香味的重要贡献因素[32]。结果表明中性蛋白酶在甜味和鲜味两项含量上高达377 mg/100 g，显著高于其他3 种酶解液，且一些对呈味有帮助的氨基酸如蛋氨酸含量丰富，更利于改善产品风味，赋予其更加圆润甘甜的口感。

2.2 感官评定结果

表5 鹅肉酶解液感官评分Table 5 Results of sensory evaluation for goose meat hydrolysates

由表5可知，4 种酶解液的共同特点是香味、浓厚感和鲜味评分普遍比较高，其中中性蛋白酶香味和鲜味的得分均为4 种酶解液中最高。蛋白酶在酶解过程中产生的疏水性氨基端会造成酶解液具有苦味，而苦味是酶解过程中应尽量避免的。对于4 种酶解液，苦味评分顺序为木瓜蛋白酶＞碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞风味蛋白酶，分别为3.30、2.10、2.00、1.50 分，这可能是因为木瓜蛋白酶是巯基蛋白酶，易于释放苦味氨基酸如赖氨酸、精氨酸以及苯丙氨酸，因此会加重酶解液的苦味[33]，但就鲜味和酸味而言，风味蛋白酶的鲜味不够且酸味明显。综上所述，感官评价实验结果说明中性蛋白酶酶解液滋味特性优于其他3 种酶解液，能更好地保留鹅肉的鲜味、浓厚感。

2.3 电子舌测定结果

利用电子舌自带分析软件对获得的4 种酶解液及梯度溶液的信号数据进行PCA，如图1所示，PC1和PC2的累计方差贡献率为93.90%，大于85%，这表明PC1和PC2中的信息量能够反映测定样品的大部分信息情况[34]。同时通过对传感器信号值进行处理区分指数达99.77，说明电子舌能够完全区分4 种蛋白酶酶解液在滋味方面存在显著的差异。

图1 不同蛋白酶酶解液电子舌PCA图Fig. 1 Principal component analysis plot for the electronic tongue results of goose meat hydrolysates prepared with different enzymes

中性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶3 种酶解液的数据点距离较近且相对集中，但距离参比溶液（0.1 mg/mL（MSG＋NaCl））最近的是中性蛋白酶酶解液，说明中性蛋白酶酶解液的鲜咸味道更突出，而碱性蛋白酶酶解液与其他3 种酶解液和参比溶液都相距较远，说明它的滋味与其他溶液有显著区别，这与感官评定的结果不完全一致，可能是酶解液本身味道复杂、电子舌滋味强度依据单一纯物质等多种原因造成的[3]。

3 结 论

采用感官结合电子舌的方法，并通过水解度、寡肽和氨基酸含量的差异分析不同蛋白酶酶解液。结果表明在45 ℃恒温水浴酶6.5 h、加酶量1 200 U/g、固液比1∶3（g/mL）的条件下，木瓜蛋白酶酶解液的水解度和寡肽质量分数最大，分别为31.41%、0.22%，其次为中性蛋白酶。但中性蛋白酶制备的鹅肉蛋白酶解液得分最高，香味、鲜味最佳，味道浓郁且甜味和鲜味呈味氨基酸的含量显著高于其他3 种酶，而木瓜蛋白酶酸味较重且鲜味比较弱，香气不协调。因此，最终确定酶解鹅肉蛋白获得呈味肽的最佳酶为中性蛋白酶。中性蛋白酶在鹅肉酶解过程中小分子肽及游离氨基酸含量不断变化，它们相互作用，使得酶解液整体鲜味浓厚，并伴有酸味，其呈味肽浓郁，持香时间久，整体风味良好。