子痫前期患者血清中miR-423-5p和miR-204-5p的表达及临床意义

尹学敬 杨占辉

河北省衡水市人民医院1产科，2介入科（河北衡水053000）

子痫前期（preeclampsia，PE）是临床上常见的一种妊娠期并发症，在妊娠20 周后出现以初发高血压及蛋白尿为主要特征的症状，可分为轻度PE和重度PE。PE 的发病率约为5% ～8%，是孕妇和新生儿死亡的主要原因之一［1］。PE 发病机制目前尚未明确，目前在临床早期尚无有效的标志物或者检测指标来预测并改善疾病预后。因此，寻找能够预测疾病进展的检测指标对于缓解PE 的进展改善孕妇和新生儿结局具有重要意义。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性单链非编码RNA分子，其包含19 ～22 个碱基，主要通过碱基互补配的原则与于靶mRNA 的3′非翻译区结合，导致靶mRNA 降解或翻译抑制从而发挥多种生物学功能。研究［2］发现miRNA 的表达与肿瘤等多种疾病发生发展关系密切。近年研究［3-5］表明，microRNA与PE 发生明显相关，且miRNA 血清学检测是一种经济、简单、有效的诊断方法，可以此作为疾病诊断的生物标志物。miR-423-5p 和miR-204-5p 是发现较早的与肿瘤发生相关的miRNA，但是miR-423-5p和miR-204-5p 在PE 的发病中的研究较少。近来，有文献［6-7］分别报道，miR-423-5p 在PE 早期孕妇胎盘组织和血清中表达升高，miR-204-5p 在妊高症患者血清中［8］和在PE 患者胎盘组织中表达升高［9］。因此，笔者推测，血清中miR-423-5p 和miR-204-5p水平检测可能与PE 的发生发展及结局有关。本研究对79 例PE 患者进行血清miR-423-5p 和miR-204-5p 水平联合检测，分析其与PE 发病的关系、诊断价值和预后判断，以期为PE 临床诊断提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2017年10月至2018年9月于我科定期行产前检查并分娩的PE 孕妇79 例，按照第8 版《妇产科学》中相关标准分为轻度PE 组（40 例）和重度PE 组（39 例）。另选取同期正常孕妇100 例作为对照组。纳入标准：年龄20 ～40 岁，产检孕周20 ～28 周，所选孕妇均为单胎。排除标准：（1）既往有高血压、冠心病、糖尿病、慢性肾炎和自身免疫病等；（2）严重的肝肾功能不全、心功能不全；（3）既往有前置胎盘、胎盘早剥、流产、早产等不良妊娠结局者。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均已签署知情同意书。

1.2 观察指标研究对象入院后记录入院年龄、孕龄，测量血压，均由专业妇产科医师或护士完成。常规指标：抽取静脉血检测血常规，24 h 尿蛋白：PE 患者留取24 h 尿液，自排空膀胱后开始计时。留取尿液前先清洁外阴，将留取尿液置入清洁的容器内，病情严重者留置导尿管留取标本，全部尿液混匀后送检验科，测定24 h 尿蛋白。仪器设备：应用日本Sysmex 型血球计数仪分析血常规；样本血液生化指标的检测采用日立7600-020型全自动生化分析仪；使用罗氏Cobas 8000 全自动生化分析仪测定24 h 尿蛋白水平。对患者进行追踪、随访，完善患者终止妊娠时的孕周时间、血压情况及新生儿体质量情况等数据资料。

1.3 血清miRNA 的提取和miR-204-5p和miR-423-5p 表达水平检测静脉血10 mL，4 ℃1 600 ×g离心10 min，将上清液转移到另一个新的2 mL 无酶离心管中，4 ℃16 000 ×g再次离心10 min，吸取上层血清转移到新的2 mL 无酶离心管中，即为处理好的血清标本，于-80 ℃冻存备用。miRNeasy Serum/Plasma Kit（德国Qiagen公司）提取小RNA，在紫外分光光度计上测浓度，然后将浓度均调整为1 μg/μL；利 用miRNeasy Serum/Plasma Spike-In control（德国Qiagen 公司）进行标化；利用miScriptⅡReverse Transcription Kit（德国Qiagen 公司）将小RNA 逆转录为cDNA；利用miScript SYBR Green PCR Kit（德国Qiagen 公司）进行Real time PCR，检测血清中的miR-204-5p 和miR-423-5p 的表达水平。qPCR 反应引物序列见表1；PCR 反应条件：为预变性95 ℃15 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，70 ℃30 s，扩增40 个循环。所有样品均做3 个平行孔，循环数取其均数。每个样品目的基因的Ct 用加入的外参基因线虫cel-miR-39 来标化，从而校正加入的RNA 量，ΔCt目的基因= Ct目的基因-Ctcel-miR-39，分别获得两组每个标本的ΔCt 值，2-ΔΔCt表示目的基因相对表达水平，即miR-204-5p和miR-423-5p表达水平。

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析，计量资料用K-S 法进行正态性检验，正态分布计量资料用（）表示；非正态计量资料采用M（Q1，Q3）表示，计数资料采用百分比表示。多组计量资料比较如服从正态分布且方差齐性，采用单因素方差分析，若方差不齐或非正态分布用Kruskal-Wallis 检验和Mann-whitney 两两比较；变量间相关性采用Pearson 相关分析；构建受试者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲线评价miR-423-5p 和miR-204-5p 的诊断价值。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料比较各组孕妇年龄、孕龄、收缩压、舒张压、24 h 尿蛋白比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。轻度PE 组与重度PE 组的收缩压、舒张压24 h 尿蛋白明显高于对照组（P＜0.05），且重度PE 组显著高于轻度PE 组（P＜0.05）。轻度PE组与重度PE 组孕龄显著高于对照组（P＜0.05）；轻度PE 组与重度PE 组新生儿体质量显著低于对照组，而轻度PE 组与重度PE 组比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 3 组间相关指标比较Tab.2 Comparison of related indicators among three groups M（Q1，Q3）

2.2 3 组血清miR-423-5p 和miR-204-5p 水平qRT-PCR 检测miR-423-5p 和miR-204-5p 在PE 患者及对照组中的差异表达，结果提示与对照组比较，miR-423-5p 和miR-204-5p 在PE 患者中的表达明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.05）；进一步分析发现，miR-423-5p 和miR-204-5p 在重度PE 组表达高于轻度PE 组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 miR-423-5p 和miR-204-5p 在PE 患者血清中的表达Fig.1 Expression of serum miR-423-5p 和miR-204-5p in PE patients

2.3 血清miR-423-5p 和miR-204-5p 表达水平与各临床指标与妊娠结局相关性分析Pearson 相关分析表明，miR-423-5p 表达与年龄、收缩压、舒张压、24 h 尿蛋白定量呈正相关关系，miR-204-5p 表达与收缩压、舒张压、24 h 尿蛋白定量呈正相关，miR-423-5p 和miR-204-5p 表达均与孕龄、新生儿体质量呈负相关（P＜0.05）。见表3。

2.4 诊断价值分析血清miR-423-5p 和miR-204-5p 对PE 进行联合预测时曲线下面积为0.916。当截断值为0.48 时，诊断价值最高，其灵敏度为78.5%，特异度是96%，且联合诊断PE 的AUC 大于单独诊断的AUC。见表4、图2。

3 讨论

PE 是一种妊娠期特有疾病，近年来发病率呈逐年上升趋势，且病死率较高［10］，严重者可导致产妇子痫、心肝肾等重要脏器功能会出现不同程度变化，心脏衰竭等各种并发症，胎儿生长受限和脑瘫，是导致孕产妇及新生儿死亡的主要原因之一［11］。因此寻找一种在疾病发生早期可灵敏诊断且对疾病病情及预后有评估作用的标志物成为了目前临床研究的重点。大量数据表明，多种疾病患者外周血中miRNA 表达谱与健康对照患者不同，且其表达具有组织特异性。但是有关PE 患者循环血中miRNA 表达的报道较少。且既往报道中，多以正常孕妇血清和PE 两组血清中miRNA 表达失衡为研究切入点，而两种miRNA 在PE 患者血清学水平联合检测的价值则鲜见报道。本研究重点探讨血清miR-423-5p 和miR-204-5p 在PE 诊断中的价值及与病情严重程度的关系。

表3 血清miR-423-5p 和miR-204-5p 与临床指标及妊娠结局相关分析Tab.3 Analysis of the correlation between serum miR-423-5p and miR-204-5p and clinical indicators or pregnancy outcomes

表4 血清miR-423-5p 和miR-204-5p 对PE 诊断价值的比较Tab.4 Comparison of diagnostic value of miR-423-5p and miR-204-5p in serum for PE

图2 血 清miR-423-5p 和miR-204-5p 预测PE 的ROC 曲线Fig.2 ROC curve of serum miR-423-5p and miR-204-5p in predicting preeclampsia

miR-423-5p 在多种疾病中表达异常，如心衰患者循环miR-423-5p 表达升高，且与左室肥厚程度相关［12］。另外，许多研究［13］证实，miR-423-5p 在肿瘤组织中表达失调，参与了多种肿瘤的发生发展，但在不同肿瘤中发挥不同作用。miR-423-5p在前列腺癌组织中表达上调，miR-423-5p 可抑制前列腺的肿瘤发展。而在骨肉瘤组织中，miR-423-5p 表达下调，抑制miR-423-5p 表达可以抑制骨肉瘤的增殖和侵袭［14］。近年研究［6-7］也发现，在PE孕妇胎盘组织和血清中miR-423-5p 表达异常，但在研究［7］中，miR-423-5p 的表达差异仅表现在疾病的早期。本研究结果显示，PE 组miR-423-5p 表达水平高于对照组，与TIMOFEEVA 等［7］研究的结果一致。不同的是，本研究观察了miR-423-5p 表达与临床指标的相关性分析，进一步提示了miR-423-5p 与PE 的 相 关 性。

miR-204-5p 的抗肿瘤效应已被广泛证实。如在黑色素瘤细胞中，miR-204-5p 模拟物可抑制肿瘤细胞侵袭［15］。miR-204-5p 可抑制肝癌细胞增殖［16］、调节乳腺癌细胞的生长、转移以及代谢［17］。另外，miR-204-5p 也作为血清标志物判断前列腺癌转移情况［18］。目前已有研究［19］以miR-204-5p 为靶点治疗肿瘤，得到较好的效果。近来研究［8］发现，妊高症患者血清miR-204-5p 表达升高，可作为诊断预防治疗的生物标志。也有研究［9］发现，miR-204-5p 在PE 患者胎盘组织中表达明显增高，且能够通过下调MMP-9 的表达使滋养细胞增殖和侵袭能力下降，与PE 的发病有关。本研究结果显示，PE 组miR-204-5p 表达水平高于对照组，并进一步对miR-204-5p 表达与临床指标的相关性进行分析，提示了miR-204-5p 与PE 的相关性。

本研究显示，PE 组孕妇miR-423-5p 和miR-204-5p 值显著高于对照组，与国内外研究结果一致。不仅如此相关性分析发现miR-423-5p 和miR-204-5p 与收缩压、舒张压、24 h 尿蛋白呈正相关，与孕龄和新生儿体质量呈负相关。血清miR-423-5p 和miR-204-5p 对PE 进行联合预测时曲线下面积为0.916，且联合诊断PE 的AUC 大于单独诊断的AUC，提示了二者联合检测PE 患者血清诊断的价值更高。但本研究存在标本量小的不足，结果存在一定局限性，但是对血清miR-423-5p 和miR-204-5p 用于PE 诊断、治疗和预后评估具有积极的意义，因此，研究结果还需要大样本量的数据支持，有待进一步深入研究和探讨。