心脉隆注射液对阿霉素小鼠心脏损伤的保护作用及其机制

田冬梅 袁李礼

1安徽医科大学第一附属医院急诊科（合肥230022）；2湖南省脑科医院心内科（长沙410007）

阿霉素是一种临床应用广泛的蒽环类抗肿瘤药［1］，效果显著，但其所使用过程中会造成心脏毒性效应等不良反应，限制其临床应用，严重影响患者的治疗效果和生存质量［2］。研究表明阿霉素化疗2年内心脏损伤的发生率超过一半［3］，心脏毒性效应的防治是临床和基础关注的研究热点。心脉隆注射液是美洲大蠊中分离出的一种国家二类新药，主要用于治疗慢性心力衰竭［4］，研究［5-7］报道其能具有心脏保护功能。阿霉素造成心脏毒性效应可能与心肌凋亡有关［8］，自噬与凋亡之间存有交互调控。而心脉隆注射液对于阿霉素心脏损伤动物模型的作用机制是否与凋亡-自噬相关仍不完全明确。本研究拟观察心脉隆注射液对阿霉素小鼠心脏损伤的保护作用的影响，并进一步探讨其可能机制，为其用于防治临床阿霉素心脏损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级雄性C57BL/6 小鼠30 只，体质量（32 ± 2）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。小鼠常规饲养于湖南省人民医院动物实验中心，环境温度保持在（23 ± 2）℃，湿度维持在40% ～60%，明暗交替时间12 h/12 h。

1.2 材料和试剂心脉隆注射液购自云南腾药制药股份有限公司、阿霉素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、乳酸脱氢酶（LDH）和磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB）检测采用日立7600 型全自动生化分析仪、HE 染液和DAB 显色试剂购自武汉谷歌生物科技有限公司、一步法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自江苏碧云天生物科技有限公司、兔抗LC3 单克隆抗体、相应二抗购自美国Sigma公司。

1.3 动物模型与分组SPF 级雄性C57BL/6 小鼠30 只随机分为3 组。对照组10 只：腹腔注射等体积生理盐水7 d；阿霉素组10 只：腹腔注射阿霉素10 mg/kg 2 d+腹腔注射等体积生理盐水5 d；心脉隆+阿霉素组10 只：腹腔注射阿霉素10 mg/kg 2 d+腹腔注射心脉隆注射液250 mg/kg 5 d。

1.4 样本收集小鼠处理7 d 后，腹腔注射水合氯醛麻醉后心脏穿刺采血，3 000 r/min 离心收集血清，用于心肌酶学指标检测。心肌组织收集后用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，用于HE 染色、组织凋亡和自噬分析。

1.5 指标检测

1.5.1 HE 染色将切片脱蜡至水、苏木素染色、伊红染色、脱水封片后显微镜观察。

1.5.2 心肌酶学指标检测取200 μL 血清，通过全自动生化分析仪检测LDH 和CK-MB 水平。

1.5.3 心肌组织凋亡检测TUNEL 将切片脱蜡至水、修复破膜后，利用TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒检测，用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察，随机选择10 个视野进行计数分析，计算凋亡指数（AI）= 凋亡细胞数/细胞总数× 100%。

1.5.4 心肌组织自噬检测将切片脱蜡至水、抗原修复后血清封闭、LC3 一抗4 ℃孵育过夜、二抗孵育、DAB 显色复染细胞核，脱水封片后显微镜观察，随机选择10 个视野进行计数分析。

1.6 统计学方法数据分析采用SPSS 20.0 统计学软件，数据采用均数± 标准差表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行组间比较，最小显著性差异法（LSD）进行两两比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心脉隆注射液对阿霉素小鼠心脏组织病理的影响HE 染色结果显示，阿霉素能导致小鼠心脏组织纤维细胞和肌节结构紊乱、局部炎症细胞浸润，心脉隆处理改善阿霉素小鼠心肌组织上述形态学变化，见图1。

图1 心脉隆注射液对阿霉素小鼠心脏组织病理的影响Fig.1 Effect of Xinmailong injection on doxorubicin-induced cardiac histopathology in mice

2.2 心脉隆注射液对阿霉素小鼠心肌酶学指标的影响心肌酶学指标检测显示，与对照组相比，阿霉素引起小鼠LDH 和CK-MB 升高（P＜0.05），心脉隆处理组小鼠LDH 和CK-MB 较阿霉素模型组降低（P＜0.05），见图2。

图2 心脉隆注射液对阿霉素小鼠心肌酶学指标的影响Fig.2 Effect of Xinmailong injection on doxorubicin-induced myocardial enzymes in mice

2.3 心脉隆注射液对阿霉素小鼠心脏组织细胞凋亡的影响TUNEL 实验显示，正常组小鼠心脏组织细胞凋亡指数低于5%，阿霉素能够引起小鼠心脏组织细胞凋亡指数（绿色荧光增多）（P＜0.05），心脉隆处理能够降低阿霉素所增加的小鼠心脏组织细胞凋亡（P＜0.05），见图3。

2.4 心脉隆注射液对阿霉素小鼠心脏组织自噬的影响LC3 免疫组化结果显示，正常组小鼠心脏组织自噬水平低，阿霉素能够诱导小鼠心脏组织自噬（棕色增多）（P＜0.05），心脉隆处理能够降低阿霉素所增加的小鼠心脏组织自噬（P＜0.05），见图4。

图3 心脉隆注射液对阿霉素小鼠心脏组织细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of Xinmailong injection on doxorubicin-induced cardiac apoptosis in mice

图4 心脉隆注射液对阿霉素小鼠心脏组织自噬的影响Fig.4 Effect of Xinmailong injection on doxorubicin-induced cardiac autophagy in mice

3 讨论

阿霉素作为一种非选择性广谱高效化疗药物，用于多种癌症的治疗，但其临床应用被其严重的副作用限制，其中最突出的是心脏损伤。本研究制备阿霉素小鼠心脏损伤模型，结果显示与对照组相比，阿霉素组心肌组织损伤、心肌酶学指标LDH 和CK-MB 升高（P＜0.05），提示模型制备成功；心脉隆注射液处理减轻阿霉素小鼠心肌组织损伤、降低心肌酶学指标（P＜0.05），明确了心脉隆注射液对阿霉素小鼠心脏损伤的保护作用，心脉隆可能作为临床防治阿霉素心脏损伤的潜在药物。

目前关于阿霉素导致的心脏损伤的机制很多，细胞凋亡对于生物体的发育及体内稳态平衡中起作用［9］。阿霉素诱导的心肌细胞凋亡在心脏损伤中发挥重要作用［10］。阿霉素诱导心肌细胞凋亡的发生机制涉及多个方面［11］：（1）阿霉素诱导心肌细胞膜Fas 和FasL 表达，增加Fas/FasL 结合，激活Caspase-8 启动凋亡；（2）阿霉素导致线粒体膜通透性转运孔开放，膜电位降低，细胞色素C 释放至胞浆，激活Caspase-9 启动凋亡；（3）阿霉素心肌细胞丝裂原活化蛋白激酶途径，促进促凋亡基因Bax 表达，抑制抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL 表达，从而导致凋亡；（4）阿霉素增加P53 蛋白表达和心肌细胞凋亡，且不受Caspase 抑制剂的影响。抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡能够有效防止其导致的心脏损伤，本研究结果证实阿霉素能引起小鼠心脏组织细胞凋亡，心脉隆注射液处理后抑制心脏组织细胞凋亡，提示心脉隆注射液对阿霉素心脏损伤的保护作用可能与其减轻细胞凋亡相关。

自噬与凋亡之间存有交互调控，二者能被多种刺激激活、互相转化［12］。阿霉素能影响自噬，但自噬在心肌细胞的存活和死亡中具有双重作用。研究发现预处理所引起的自噬能对抗阿霉素的心脏毒性，利用自噬诱导剂雷帕霉素能减轻阿霉素诱导的心脏毒性［13］，适度饥饿导致的自噬同样也能减轻阿霉素的急性心脏损伤［14］。而阿霉素所诱导的自噬则更多的与其心脏毒性相关，且呈现出复杂性。自噬的过程包括几个步骤，包括自噬双层膜结构和自噬体的形成，自噬体和溶酶体的融合和降解。透射电子显微镜观察显示阿霉素增加心肌组织细胞中自噬体的形成和累积［15］。阿霉素能够通过抑制溶酶体从而抑制自噬流，自噬体无法通过溶酶体降解而聚集，导致心肌细胞内有害物质聚积，促进心肌细胞凋亡和心脏损伤［16］。自噬抑制剂3-MA、Beclin-1 或ATG5 等自噬相关基因沉默均可对抗阿霉素的心脏损伤［17］。本研究结果显示阿霉素能诱导小鼠心脏组织自噬，心脉隆注射液处理后能减轻心脏组织自噬，提示心脉隆注射液对阿霉素心脏损伤的保护作用可能其抑制自噬，从而减轻细胞凋亡相关。

本研究首次提出心脉隆注射液通过影响心肌细胞自噬/凋亡发挥发挥对阿霉素小鼠心脏损伤的保护作用，加强了其心脏保护作用的基础实验和理论依据，也将为临床防治阿霉素心脏损伤方面提供了新的潜在药物。但是本研究还具有一定的局限性，研究仅明确了心脉隆影响心肌细胞自噬/凋亡，但其具体的调控靶点还需进一步深入探讨，此外，心脉隆注射液应用于临床阿霉素心脏缺乏相关的临床大数据支持，仍需要开展更多的多中心临床试验观察。综上所述，心脉隆注射液能够减轻心肌组织细胞凋亡和自噬水平，发挥对阿霉素小鼠心脏损伤的保护作用。本研究为临床预防和治疗阿霉素心脏损伤提供新的思路和实验依据。