青钱柳黄酮对大豆油氧化的影响

郭彤彤，陈玉慧，张 鑫*，郑晓杰

(1. 宁波大学食品与药学学院，浙江 宁波 315800； 2. 温州科技职业学院，农业与生物技术学院，浙江 温州 325006)

青钱柳(Cyclocaryapaliurus)系我国特有的胡桃科、青钱柳属落叶乔木，又称为青钱李、金钱柳、摇钱树等，广泛分布于我国南方地区。青钱柳具有清热解暑、抗疲劳等多种功效，在我国作茶已有上千年历史[1,2]。青钱柳提取物中不仅含有人体必需的钾、钙、镁、磷等金属元素，还富含各种具有保健功能的微量元素。此外，黄酮类化合物也是青钱柳中重要的成分，青钱柳黄酮结构复杂，表现出多种生理活性，具有抗炎杀菌、降血脂、降血糖、抗氧化及增强免疫力等药理功能[3,4]，近年来已成为国内外的研究热点。

大豆油是从大豆中压榨提取出来的一种油，也称为“大豆色拉油”，是我国主要食用油之一，含有较多亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸[5]，经常食用对于维护人体健康具有积极作用。然而大豆油的保质期较短，由于氧化酸败，造成营养成分的破坏和营养价值的降低[6]。随着现代食品加工方法的不断发展，抗氧化剂所引起的健康问题受到人们的持续关注[7,8]。黄酮作为青钱柳中重要生物活性成分，表现出良好的抗氧化活性。作为一种高效、安全的天然抗氧化剂，将青钱柳黄酮应用于食用油脂及油基食品中，既可发挥抗氧化作用，又可保证食品安全。

本研究拟在实验室之前的工作基础上，利用大孔树脂分离纯化青钱柳黄酮，并通过研究青钱柳黄酮的体外抗氧化活性以及抑制大豆油氧化的活性，为青钱柳黄酮资源的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青钱柳由浙江省文成县泉山中药材种植有限公司提供，去除杂质和枝杆之后，粉碎备用。聚酰胺树脂购于青岛海洋化工有限公司； VE，上海阿拉丁试剂有限公司；DPPH和ABTS，Sigma公司；TPTZ，Fluka公司；TBHQ，上海晶纯试剂有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Laborota 4000真空旋转蒸发仪，德国Heidolph公司；SHB-III型循环水式真空泵，郑州长城科工贸有限公司；冷冻干燥机，宁波新芝公司；AY-120电子精密天平，日本Shimadzu公司；电热恒温干燥箱，上海跃进医疗机械厂。

1.3 实验方法

1.3.1 青钱柳黄酮样品的制备

称取适量的粉碎青钱柳粉末，按照料液比1:20加入热水，在60℃恒温振荡器中振荡提取40 min，4500×g的条件下离心15 min得上清液，残渣用同样方法再次浸提，合并两次上清液并浓缩、冻干，得到青钱柳黄酮粗提物。

将青钱柳黄酮粗提物制成2%质量分数的溶液，经0.45 μm滤膜过滤后上聚酰胺层析柱(30 cm×1.6 cm)。首先用水洗去水溶性杂质，洗脱流速为2.0 mL/min，洗脱2 BV(BV为柱床体积)后，用80%的乙醇洗脱，采用自动部分收集器收集洗脱液(10 mL/管)，浓缩、冻干，得到青钱柳黄酮样品。

1.3.2 青钱柳黄酮含量的测定

标准曲线的绘制：精密称取芦丁标准品用80%乙醇定容，配成浓度0.4 mg/mL的芦丁标准品溶液。配置不同浓度芦丁标准品溶液1.0 mL分别置于10 mL试管中，分别加入50 mg/mL亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min后加入10 mg/mL硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min后加入40 mg/mL氢氧化钠溶液4 mL，加水至刻度，混匀放置15 min。在509 nm波长范围测定吸光度，以吸光度为横坐标，芦丁标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线[4]。称取青钱柳黄酮样品粉末溶于40%乙醇，按标准曲线中所述测定方法测定吸光度，根据回归方程计算样品中的总黄酮含量。

1.3.3 青钱柳黄酮体外抗氧化活性测定

1.3.3.1 DPPH法抗氧化活性的测定

抗氧化能力的测定参照Liu等的方法[9]，称取适量DPPH，以无水乙醇定容得0.1 mmol/L的溶液。取此溶液3 mL，加入不同质量浓度样品液1 mL，室温反应30 min，于517 nm 波长处测定吸光度，空白组以1 mL无水乙醇代替样品液，并按下式计算清除率：

DPPH自由基清除率/% =

(1-A试样/A空白) × 100%

注：A试样为样品的吸光度，A空白为空白组的吸光度。

1.3.3.2 TEAC法抗氧化活性的测定

TEAC法抗氧化活性的测定参照Stratil等的方法[10]。将7.0 mM ABTS与4.95 mM过硫酸钾溶液等体积混合，于室温、暗处反应12 h，形成蓝绿色的ABTS+溶液，并将其734 nm处的光吸收值稀释调整为1.3。以2.0 mM Trolox的磷酸盐溶液作为标准贮液，用时稀释，并做出反应标准曲线。

取3.9 mL ABTS+溶液与0.1 mL样品液混合、摇匀，37℃水浴反应并计时，以磷酸盐缓冲液调零，测定反应液在第10 min时734 nm处的吸光值Ai，同时测定3.9 mL ABTS+溶液与0.1 mL的磷酸盐缓冲液的吸光光度值Ac，3.9 mL的磷酸盐缓冲液与0.1 mL的样品液吸光光度值Aj，计算吸光光度值减少度ΔA(ΔATrolox = (Ac- Ai) - Ai)，根据Trolox反应标准曲线计算TEAC值。

1.3.3.3 FRAP法抗氧化活性的测定

参照Benzie等的方法[11]，取0.2 mL样品溶液加入3.0 mL FRAP试剂(由300 mM 醋酸盐缓冲液300 mL、10 mM TPTZ溶液30 mL、20 mM FeCl3·6H2O溶液30 mL组成)，混匀后37℃反应10 min，测定593 nm处吸光值的增加，以1.0 mM FeSO4为对照，样品抗氧化活性(FRAP值)以达到同样吸光度所需FeSO4的毫摩尔数表示。

1.3.4 青钱柳黄酮对于大豆油抗氧化活性的测定

1.3.4.1 实验样品的处理

将不同质量青钱柳黄酮添加到大豆油中，青钱柳黄酮的终浓度分别为10-3mg/mL(CPF-low)，2.5×10-3mg/mL(CPF-middle)和5×10-2mg/mL(CPF-high)，同时将合成抗氧化剂TBHQ和BHT分别添加到大豆油中，终浓度均为10-3mg/mL。将样品置于磁力搅拌器上25℃搅拌30 min，使抗氧化剂充分溶解在大豆油中。然后将所有样品置于60℃烘箱，第3、6、9、12、15 d时测定过氧化值、共轭双烯值和茴香胺值。在模拟烹饪过程中，将各样品加热至150℃维持5 min，分别测定过氧化值、共轭双烯值和茴香胺值。

1.3.4.2 过氧化值的测定

参照李丹丹的方法[12]，准确称取20 mg油样，加0.5 mL氯仿-冰醋酸(V:V=2:3)溶解，加入0.05 mL碘化钾饱和溶液，振荡30 s后暗处放置3 min，取出加入显色剂至10 mL，混匀后静置5 min，在580 nm处测定其吸光度。

过氧化值= 6A/1000m×100×78.8

A：从标准曲线求得的样品测定液的含碘量(μg)；m：样品的质量(g)。

1.3.4.3 共轭双烯值的测定

参照Wettasinghe和Shahidi的方法[13]，准确称取20 mg油样溶解于25 mL异辛烷中，混合均匀，测定其在234 nm处的吸光值，用异辛烷做空白。共轭双烯值的计算采用下面的公式：

共轭双烯值=234 nm处的吸光值/

(油的浓度 g/100 mL×比色杯的厚度)

1.3.4.4 茴香胺值的测定

参照我们之前建立的方法[7]，准确称取2.0 g油样，用异辛烷溶解并稀释定容至25 mL成为未反应溶液，用异辛烷溶剂作参比，在350 nm处测定其吸光度A0。用移液管吸取未反应溶液5 mL置于10 mL试管中，加入1 mL p-茴香胺冰醋酸溶液，10 min后在350 nm处测定其吸光度A1。按下式计算：

茴香胺值= V/m × (1.2A1- A0)

V：溶解试样的体积(mL)；m：试样的质量(g)。

1.3.5 数据分析

所有实验数据均测定3次取平均值，采用SPSS软件(SPSS Inc.， Chicago，IL，USA)进行方差分析，P<0.05表示显著差异。

2 结果与分析

2.1 青钱柳黄酮及三萜样品的制备

青钱柳经热水浸提，浓缩和冷冻干燥，得到黄酮粗提物。由于粗提物中含有一定量茶多糖等杂质，因此根据黄酮特性，选取聚酰胺树脂，利用大孔树脂柱层析法对其进行分离纯化。经过聚酰胺大孔树脂柱层析分离之后，青钱柳中黄酮的含量大于95%。

2.2 青钱柳黄酮体外抗氧化活性研究

2.2.1 DPPH法测定青钱柳黄酮抗氧化活性

自由基具有高度的化学活性，是人体生命活动中多种生化反应的中间代谢物质。在正常情况下，机体内的自由基处于不断产生与清除的动态平衡之中。自由基产生过多，就会通过攻击生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子、细胞及组织器官水平的各种损伤，加速机体衰老过程并诱发各种疾病[14]。

DPPH自由基是一种合成的有机自由基，常用来研究酚类抗氧化剂的构效关系。在有自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收消失，其退色程度与其接受的电子数成定量关系，因而可用分光光度计进行分析。样品的DPPH自由基清除活性的结果如图1(A)所示。样品的DPPH自由基清除活性呈浓度依赖性变化。在样品浓度为0.1 mg/m时，V和青钱柳黄酮的DPPH自由基清除活性分别为63.74%和35.33%。

2.2.2 TEAC法测定青钱柳黄酮抗氧化活性

TEAC法是以ABTS这种水溶性的自由基引发剂为显色剂，ABTS经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+，向其中加入被测物质。如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与ABTS+发生反应而使反应体系褪色，引起734 nm吸光度的变化[15]。与含Trolox的对照标准体系比较，换算出被测物质总的抗氧化能力，结果表示为与一定量提取物具有相同抗氧化活性的Trolox的浓度。因此也把该方法称为TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC)法。与样品的ABTS+·自由基清除活性的结果如图1(B)所示，样品对ABTS+·的清除活性呈浓度依赖性变化，同时VE和青钱柳黄酮清除ABTS+·自由基的IC50值分别为0.028 mg/mL和0.078 mg/mL。

2.2.3 FRAP法测定青钱柳黄酮抗氧化活性

FRAP法的原理为Fe3+-TPTZ可被样品中还原物质还原为Fe2+-TPTZ，溶液变成深蓝色，并于593 nm处具有最大吸收值，根据吸光度的大小计算样品抗氧化活性的强弱[16]。在还原体系中，各样品对于Fe3+均有一定的还原能力，且还原能力随浓度的升高而增强(图1C)。在相同浓度下，VE的Fe3+还原能力强于青钱柳黄酮，但是青钱柳黄酮同样具有较强的抗氧化活性。

图1 通过DPPH法(A)、ABTS法(B)及FRAP法(C)测定青钱柳黄酮的抗氧化活性Fig. 1 Antioxidant activities of C. paliurus flavonoids determined by DPPH free radical-scavenging assay (A), ABTS assay (B), and FRAP assay (C).

2.3 青钱柳黄酮对大豆油抗氧化活性研究

2.3.1 不同抗氧化剂对大豆油过氧化值的影响

油脂氧化是引起油脂酸败的主要原因之一，油脂不饱和脂肪酸在氧化过程中过氧化物的形成使过氧化值升高。从图2A中可以看出，TBHQ抑制大豆油生成过氧化物的作用最强，而制备得到的青钱柳黄酮对大豆油同样具有较强的抗氧化作用，且存在剂量依赖关系。随着青钱柳黄酮含量的升高，大豆油的过氧化值下降，说明其抑制大豆油生成过氧化物的能力也加强。从图2B中可以看出，在经过高温150℃处理5 min后，各样品的过氧化值均显著上升，在此模拟烹饪过程中，与模拟贮藏过程的结果类似，TBHQ抑制大豆油生成过氧化物的作用最强，同时，青钱柳黄酮对于抑制大豆油高温烹饪过程的氧化，也发挥了积极作用，而且存在剂量依赖关系，在添加大豆油青钱柳黄酮的样品中，过氧化值均显著低于空白对照(P<0.05)。

2.3.2 不同抗氧化剂对大豆油共轭双烯值的影响

共轭双烯值反映不饱和脂肪酸氧化初始形成的共轭双键的数量。由图2C可以看出，用青钱柳黄酮和人工合成抗氧化剂TBHQ处理过的大豆油中，共轭双烯值明显降低。随着青钱柳黄酮含量的增加，其抑制大豆油生成过共轭双键的能力越来越强。在实验选取的浓度范围内，青钱柳黄酮抑制大豆油生成过共轭双键的能力均小TBHQ(P<0.05)，结果表明青钱柳黄酮具有较强抑制大豆油生成过共轭双键的能力，即具有较强的抑制大豆油氧化的能力。在经过高温150℃处理5 min后，各样品的共轭双烯值均显著上升，如图2D所示。青钱柳黄酮抑制大豆油生成过共轭双键的能力显著高于空白对照(P<0.05)，且存在剂量依赖关系，说明青钱柳黄酮在高温烹饪条件下显著抑制了大豆油的氧化。

2.3.3 不同抗氧化剂对大豆油茴香胺值的影响

大豆油中醛类化合物的含量，可以用茴香胺值表示，其数值越大，油脂的劣变程度越严重。新鲜的精炼油茴香胺值很低，当食用油脂储藏不当，茴香胺值则显著上升。

由图2E可以看出，茴香胺值随着大豆油储存时间的延长而增大。合成抗氧化剂TBHQ抑制大豆油氧化的效果最好，同时青钱柳黄酮的作用具有剂量效应关系，随着剂量的增大，大豆油茴香胺值相对下降，说明青钱柳黄酮有效抑制了大豆油在贮藏过程中的劣变。从图2F中可以看出，在模拟高温烹饪过程150℃处理5 min后，各样品的茴香胺值均显著上升。有研究报道，虽然茴香胺值作为控制植物油常温储存的品质变化的指标并不敏感，但可以作为高温储存或煎炸过程中检验油脂品质的指标[12]。在本实验中，TBHQ显著抑制了大豆油茴香胺值的升高，同时青钱柳黄酮对于抑制大豆油茴香胺值升高的能力显著高于空白对照(P< 0.05)，而且存在剂量依赖关系，说明青钱柳黄酮在高温烹饪过程中，能够有效防止油脂品质的劣变。

图2 添加青钱柳黄酮与TBHQ的大豆油中贮藏过程过氧化值(A)、烹饪过程过氧化值(B)、贮藏过程共轭双烯值(C)、烹饪过程共轭双烯值(D)、贮藏过程茴香胺值(E)和烹饪过程茴香胺值(F)的比较Fig. 2 Comparison of the addition of C. paliurus flavonoids and TBHQin soybean oil with respect to peroxide value in storage (A) and cooking process (B), diene value in storage (C) and cooking process (D), anisidine value in storage (E) and cooking process (F).

3 结论

大豆油中的不饱和脂肪酸易与空气中的氧气发生反应，进行氧化和分解，产生强烈刺激性气味，生成过氧化脂质，即为“酸败”[17]。由于大豆油中不饱和脂肪酸的含量相对较高，加工及贮藏过程中如何降低不饱和脂肪酸的氧化程度，值得关注。氧化酸败的大豆油不仅营养素被破坏，同时还会产生异味及有毒有害物质，危害食用者身体健康。防止发生氧化酸败，保证食用油质量安全成为食用油生产及储藏中的关键问题。

除了精加工、密封、充氮包装外，添加抗氧化剂是储藏食用油简单、经济的方法[18]。抗氧化剂可以分为合成抗氧化剂和天然抗氧化剂，目前食品工业一直采用添加人工合成抗氧化抑制油脂在加工与储存期间发生的氧化反应，它们对防止食用油氧化酸败具有较好效果。但动物试验表明，BHT(Butylated hydroxytoluene，BHT)和TBHQ均有一定毒性和致癌作用[19]，再加上人们对合成食品添加剂的怀疑和排斥心理，这些合成抗氧化剂的使用受到限制，所以安全性高、抗氧化能力强、无毒副作用的天然抗氧化剂日益受到关注。天然抗氧化剂在油脂保护中的应用也成为油脂化学的研究热点，有报道表明，植物多酚提取物具有显著的保护植物油过氧化的作用[20,21]。

作为天然抗氧化剂，青钱柳黄酮具有安全、高效、无毒等特点，同时又具有抗炎、杀菌、抗病毒、降血脂、降血糖及抗氧化等多种生理功能，不仅能有效减缓食用大豆油氧化酸败，延长其贮藏期限，而且可以预防人体多种疾病，提升人体健康状态，同时避免了合成抗氧化剂所带来的食品安全问题。因此，以天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂将会是今后食用油产业发展的大趋势。本实验以中国特产青钱柳为原料，制备得到了高纯度的青钱柳黄酮。体外抗氧化实验结果表明，青钱柳黄酮具有较强的体外抗氧化活性；在贮藏及高温烹饪时，青钱柳黄酮能够较为明显的抑制大豆油氧化。在高度重视发展天然抗氧化剂的当今，在油脂行业开发应用这种具有保健功能的青钱柳黄酮资源，具有重要理论价值。