基于网络药理学的金盏银盘作用机制研究

朱卫星，成聪聪，甘国兴，申 雪，袁月梅，姚美村*

(1. 清远市中医院，广东 清远 511510； 2. 中山大学药学院，广东 广州 510006； 3. 沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110016)

金盏银盘(Bidensbiternata(Lour.) Merr. et Sherff.)是菊科鬼针草属植物，以全草入药，始载于唐代《本草拾遗》，味苦、平，无毒[1-2]，具有疏散风热、清热解毒之效，临床用于治疗风热感冒、毒蛇咬伤、肠痈、湿热泻痢，也可外用于痔疮等[3]。研究发现鬼针草属植物主要含黄酮类、聚炔苷、苯丙素类、氨基酸及挥发油等多种成分，具有抑菌、保护心血管、抗炎镇痛、抗干眼、抗衰老等多种药理活性，常用于感冒、阑尾炎、痢疾、胃痛、高胰岛素血症等疾病的防治[4-7]。

随着现代分子生物学、基因组学、转录组学和蛋白组学等学科的发展，药物治疗疾病的研究已进入到细胞层面和基因水平[8]。不同于化学药单靶点、高选择性的特征，中药具有多成分、多靶点协同作用的特点，这种复杂性常常使得中药药效物质基础不明确、作用机制不清楚[9]，很大程度上限制了对中药的深入研究。但随着网络药理学的兴起，通过网络分析，构建“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，系统地分析药物对疾病网络的干预与影响，揭示药物多成分协同作用的机理已成为可能；而且这种研究方法与中医药整体观和辨证论治等不谋而合，为中药研究从系统生物学角度提供了新的思路与研究方法[10-11]。

本研究采用网络药理学的研究思路和方法，以传统药理学为理论基础，网络功能模块识别为技术手段，利用相关软件构建“成分-靶点和成分-靶点-通路”网络图，分析和预测鬼针草属植物金盏银盘治疗多种疾病的分子机制，为金盏银盘研究的深入开展和临床应用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 金盏银盘活性成分选择

经过前期实验结果和查阅文献，本研究选择金盏银盘中16个活性成分作为研究对象，其中将新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸，异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C异构体分别整合作为一个成分，最终确定12个活性成分进行研究。结果见表1。

1.2 活性成分潜在靶点预测

将上述化合物导入TCMSP数据库，寻找主要活性成分相关的潜在靶点，其中Okanin-O-glucoside，Okanin，Tricin-7-O-β-D-glucoside，Tri-caffeoylquinic acid等4个成分利用PubChem BioActivity Analysis Service[12]获得其潜在作用靶标。将候选化合物对应的靶点蛋白根据Uniport进行统一编号，同时获得靶点相应的基因名称，共获得58个靶点。

表1 金盏银盘的活性成分

1.3 关键靶点的GO生物学过程注释

应用STRING v10.5 数据库对金盏银盘中关键靶点进行基因本体Gene Ontology(GO)富集，分析靶点蛋白在体内可能的生物学过程。选择GO中生物过程、分子功能和细胞组成3个模块对基因进行注释，并绘制GO富集分析中相关条目的条形图，以便更直观的解释。

1.4 信号通路分析

应用STRING v10.5数据库对金盏银盘中关键靶点进行KEGG信号通路富集，物种和背景均为“Homo sapiens”进行操作，研究靶点蛋白与可能疾病之间的关系，明确金盏银盘可能的药理机制。

2 结果

2.1 成分—靶点网络分析

将筛选出的12个活性成分和靶点构建“成分—靶点”网络图，如图1所示。其中包含70个节点(12个活性成分节点和58个靶点节点)，共189条边。在网络中，每条边代表成分与靶点的潜在联系，而一个节点的度值代表网络中和节点相连路线的条数，表2列出了化合物—靶点网络中的关键靶点及度值，其中前列腺素G / H合成酶2(Prostaglandin G/H synthase 2，P35354)，蛋白酪氨酸磷酸酶的mRNA(mRNA of Protein-tyrosine phosphatase, non-receptor type 1，P18031)，胰蛋白酶1(Trypsin-1，P07477)、DNA拓扑异构酶II(DNA topoisomerase II，P11388)，凝血因子Xa(Coagulation factor Xa，P00742)等靶点出现的频率较高，表明活性成分在靶点上具有协同性，且贡献多重药理作用，可能是金盏银盘发挥药效作用的关键靶标。

图1 金盏银盘中的活性成分-靶点网络图Fig. 1 Compound-target networks in B. biternata

蛋白编号 Protein number靶点蛋白 Target protein度值 Value基因靶点 Gene targetP35354Prostaglandin G/H synthase 27PTGS2P18031mRNA of Protein-tyrosine phosphatase, non-receptor type 16PTPN1P07477Trypsin-13PRSS1P11388DNA topoisomerase II3TOP2AP00742Coagulation factor Xa3F10P11473Vitamin D3 receptor isoform VDRA2VDRP01375Tumor necrosis factor2TNFQ9NPD5Solute carrier organic anion transporter family member 1B32SLCO1B3Q9Y6L6Solute carrier organic anion transporter family member 1B12SLCO1B1P23219Prostaglandin G/H synthase 12PTGS1

2.2 GO功能富集分析

GO富集分析作为一种基因功能分类的系统，金盏银盘活性成分的GO生物学过程富集结果见图2。结果表明58个靶点可以参与体内638个生物学过程，其中分子功能、细胞组分及生物过程3个部分分别富集到33，26，579个条目。其分子功能主要涉及蛋白质结合、离子结合、催化活性及受体结合等方面；细胞组分主要包括细胞器、膜封闭腔、外泌体、细胞质及囊泡等方面；生物过程主要涉及对有机物质的反应、单一生物代谢、代谢过程调节、内源性刺激、细胞对化学刺激反应及对含氧化合物的反应等方面。

图2 GO条目在生物过程、细胞组成、分子功能上的分布(FDR<0.05)Fig. 2 GO terms for biological processes, cell composition and molecular functions(FDR<0.05)

2.3 KEGG信号通路分析

利用STRING平台对58个关键靶点进行KEGG通路富集，根据FDR(FDR<0.05)得到113条信号通路，运用京都基因和基因组百科全书数据库进行通路注释和分析，共包括6大类，其中与人类疾病相关通路共49条，与有机体系相关通路共37条，与环境信号处理系统共14条，与细胞过程相关通路共4条，与代谢相关通路共8条，与遗传信息处理相关通路共1条。表3根据FDR值列出最为显著的22条通路分析结果，分析表明阿米巴原虫病(S1)在人类疾病(传染病)相关通路中最为显著、5-羟色胺能突触(S4)在神经系统信号通路中富集最为显著且在信号转导通路中HIF-1信号通路(S9)r及TNF信号通路(S10)较为显著，表明这些通路分别与传染病、神经系统及炎症疾病等密切相关(见图3)。

表3 潜在作用通路

续表3

编号Number通路名称Pathway通路分类Classification基因数Gene numberFDRS17hsa05161:Hepatitis BHuman Diseases72.30E-06S18hsa04064:NF-kappa B signaling pathwaySignal transduction62.88E-06S19hsa05144:MalariaHuman Diseases52.91E-06S20hsa04620:Toll-like receptor signaling pathwayOrganismal Systems65.88E-06S21hsa05166:HTLV-I infectionHuman Diseases86.88E-06S22hsa05145:ToxoplasmosisHuman Diseases69.86E-06

图3 信号通路富集分析Fig. 3 Frichment analysis of signal pathway

利用Cytoscape 软件构建金盏银盘主要活性成分-靶点-通路网络，12个成分，58个蛋白与113条信号通路之间的网络关系见图4。由图可见，金盏银盘的活性成分可通过不同的靶点蛋白在不同代谢通路及疾病中发挥作用，这与中药“多组分，多靶点”的作用机理相一致。

3 讨论

为探究金盏银盘的作用机制，本研究运用网络药理学概念对金盏银盘中活性成分进行了靶点预测及网络构建，挖掘金盏银盘活性成分、靶点蛋白、信号通路3个节点网络的特征信息。结果表明，金盏银盘中12个活性成分，可作用于不同的靶点，关联的信号通路有113条，这说明中药确有多成分-多靶点-多通路的作用特点。在成分靶点分析中，前列腺素G / H合成酶2(P35354)、蛋白酪氨酸磷酸酶的mRNA(P18031)、胰蛋白酶1(P07477)、DNA拓扑异构酶II(P11388)、凝血因子Xa(P00742)等靶点的关联度较高，提示这些靶点可能是金盏银盘活性成分发挥作用的主要靶标。而在关联信号通路分析中发现阿米巴原虫病(S1)、5-羟色胺能突触(S4)、HIF-1信号通路(S9)、TNF信号通路(S10)等在人类疾病(传染病)通路、神经系统信号通路及信号转导通路的富集最为显著，这可能与金盏银盘在治疗炎症、神经系统等疾病方面的作用相关。

图4 金盏银盘中的活性成分-靶点-通路网络图Fig. 4 Compound—target protein—signaling pathway network in B. biternata

通过对金盏银盘活性成分-靶点-通路的网络药理学分析，发现抗氧化和抗炎可能是金盏银盘中主要的药理作用。金盏银盘中芦丁、金丝桃苷、绿原酸等成分，可作用于磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基(PIK3CG)、白细胞介素-8(IL8)、肿瘤坏死因子(TNF)、淀粉样β蛋白(APP)、前列腺素G / H合成酶2(PTGS2)等关键靶点，参与调控Toll样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路等信号转导过程，这可能是其参与抗氧化、抗炎的可能机制之一。林海英[13]通过采用急性炎症模型和免疫炎症模型来研究鬼针草总黄酮的抗炎作用机制，结果表明鬼针草总黄酮可降低模型大鼠中TNF-α，IL-1，IL-6，IL-8的表达，其抗炎机制可能直接通过调节炎症介质的释放来实现。胡宗福等[14]研究显示绿原酸具有清除氧自由基的作用，且清除能力与浓度相关。都波等[15]也通过体外抗氧化实验来说明金盏银盘黄酮类成分对自由基有较好的清除作用。以上文献研究均可说明金盏银盘具有明显的抗氧化和抗炎作用。

肝纤维化是一个病理生理过程，白细胞介素-6、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基、白细胞介素-1、肿瘤坏死因子等均可能参与慢性肝损伤所致的肝纤维化的发生与发展，与失常期肝硬化密切相关[16-17]。研究发现鬼针草中总黄酮具有保肝、抗肝纤维化的作用[18]，对CCL4诱导的大鼠肝纤维化可抑制其氧自由基的形成，从而达到治疗作用[19]；本研究发现金盏银盘能作用于白细胞介素-6、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基、转录因子p65、白细胞介素-1β、白细胞介素8、肿瘤坏死因子等关键靶点，并显著投射到磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)与NF-κB两个KEGG信号通路中，说明金盏银盘等鬼针草属植物抗肝纤维化的靶点与信号通路是客观存在的。

糖尿病是一种由于体内胰岛素分泌相对或绝对不足而引起的高血糖为主要特征的内分泌代谢疾病，常导致严重并发症，如神经病变、脑血管病变、肾病等[20-22]。其中糖尿病肾病是糖尿病微血管病变重要的并发症，与mTOR信号通路及HIF-1信号通路等密切相关[23]，在糖尿病肾病小鼠中，HIF-1可能是导致肾脏纤维化和肾小球硬化的主要影响因子[24]。在糖尿病中胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要特点，鬼针草总黄酮通过干预HepG2胰岛素抵抗细胞，发现其可能通过调节PI3K/AKT信号通路中的转录因子的表达来改善细胞胰岛素抵抗的作用[25]；Andeysen等[26]研究表明，绿原酸类物质在动物体内有降糖作用，其机制可能与抑制葡萄糖-6-磷酸位移酶和葡萄糖吸收有关；本研究也发现金盏银盘能作用于胰岛素受体、肿瘤坏死因子、蛋白激酶及磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基、PKA催化亚基受体等靶点，参与生物代谢、内源性刺激及调节蛋白激酶活性等GO生物过程，调控PI3K/AKT/mTOR、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、HIF-1等相关信号通路，进一步证明金盏银盘具有治疗糖尿病及其并发症的疗效，可为深入研究其作用机制提供参考。

已有研究发现绿原酸具有显著的体外抗病毒作用，对枯草杆菌、军团菌等能显著抑制其生长[27]，且鬼针草水提物与β-内酰胺类抗生素联用可降低其最小抑菌浓度[28]。本研究还发现金盏银盘可在阿米巴病、军团病、甲型流感、疟疾等KEGG通路显著富集，推测其抑菌、抗病毒及预防感冒的作用机制可能与这些通路相关。此外还发现金盏银盘能作用于前列腺素合成酶、Caspase-3、谷胱甘肽转移酶、转录因子p65等靶点，参与催化活性、蛋白结合等分子功能，以及细胞代谢、细胞增殖、脂多糖调节等生物过程，涉及5-羟色胺能突触、肿瘤调控、花生四烯酸代谢、神经退行性疾病等KEGG信号通路，因此推测金盏银盘可能还具有抗肿瘤、抗溃疡、治疗胃肠道疾病、参与花生四烯酸代谢、对心血管系统的保护等作用。

综上所述，本研究应用网络药理学原理，对金盏银盘提取物的主要成分、靶点、信号通路进行了系统研究，发现金盏银盘不仅具有抗炎及抗氧化、对肝脏保护、治疗糖尿病等药效作用，还可能具有抗肿瘤、治疗胃肠道疾病、保护心血管等作用，这对于解释金盏银盘的多成分、多靶点、多途径的药理作用提供了科学支持，为更深入研究和开发提供了参考。