基于酶-纳米颗粒试纸条可视化检测致病菌的研究

班 磊， 张 婷

（1.榆林职业技术学院，陕西榆林719000；2.浙江中医药大学，浙江杭州310053）

近年来， 全球每年有数百万的人死于水源性细菌引起的感染性疾病，因此，快速地检测和准确地识别水中致病菌对于全球公共安全和人类健康至关重要。而在各种水源性致病菌中，大肠杆菌的识别对于饮用水的微生物安全检测意义重大（Zhao 等，2017）。 传统的微生物检测方法包括选择性培养、 生物化学和血清学鉴定等 （Yin 等，2017；Martinez 等，2008），耗费人力物力且观察周期较长； 而分子检测手段如酶联免疫吸附分析法（ELISA）（Steiner 等，2010）、 侧 流 免 疫 分 析 法（LFA）（Fraden 等，2016） 以及聚合酶链式反应（PCR）（Ortiz 等，2011） 等， 这些方法虽然检测快速、灵敏，但需要昂贵的仪器和专业的技术人员。这些因素都限制了以上方法的推广使用。

目前，β-半乳糖苷酶（β-GAL）是一种常见的特异性酶，通常用于酶比色法。 通过β-半乳糖苷酶与氯苯酚红β-半乳糖苷（CPRG）发生特异性的酶-底物显色反应，由黄色变为紫红色，并进行可视化的检测与分析（Su 等，2013）。 纳米技术的快速发展有助于开发新型的检测装置用于快速灵敏地检测病原体。 针对现场即时快速检测的设计应考虑两个关键问题。首先，在环境测试或临床应用中所需的检测限（LOD）；其次，读取数据时不需要使用昂贵的仪器。为了解决这些问题，本实验研究了一种基于酶与纳米颗粒材料复合而成的比色生物传感器， 旨在建立一种即时快速检测水溶液中致病菌的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 β-半乳糖苷酶（大于500 U/mg）、氯苯酚红β-半乳糖苷（CPRG）购自Sigma 公司；纳米金颗粒（AuNPs）由实验室提供；实验所用化学试剂均为分析纯。 JEOL 100CX 电子显微镜（日本电子株式会社）；Malvern Zetasizer Nano ZS 纳米粒度电位仪 （英国马尔文仪器有限公司）；8452A二极管阵列分光光度计 （中国惠普有限公司）；Bcn136O 型生物超净工作台（上海安亭科学仪器厂）；Delta320 pH 计 （上海三申医疗器械有限公司）； 超纯水的制备采用Milli-Q 净水系统；MicrofugeR16 离心机（美国贝尔曼库尔特有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验原理 本研究设计的检测方法主要由三个部分组成：（1）β-半乳糖苷酶：一种负离子酶（PI 4.6），用于信号放大；（2）氯酚红β-D-半乳糖苷：一种显色底物，用于比色反应；（3）纳米颗粒（NPs）：一种阳离子，能够可逆地与β-GAL 结合，在不变性的情况下可以抑制该特异性酶。 当菌体存在时，会与AuNPs 结合从而释放β-GAL，β-半乳糖苷酶能水解其黄色的特异性酶底物CPRG，释放糖苷配基氯酚红形成红色的显色基团。 本实验使用的AuNPs 已被季铵盐配体所功能化，以提供高稳定性、 生物相容性和可调节表面相互作用的头， 所有这些都是稳定和灵敏的比色生物传感器所需的关键条件。 阴离子表面的菌体与阳离子颗粒表面结合从而取代了β-GAL，并伴随着酶活性的恢复。

1.2.2 AuNPs 的制备 通过将3 μL 稀释的阳离子金纳米颗粒水溶液（AuNPs，5 μM）沉积到300目经碳涂覆的铜网上来制备透射电子显微镜（TEM）所需的样品。 在室温下将样品在空气中干燥，在100 keV 的条件下获得TEM 图像，并使用Image J 图像软件进行分析。 将200 多个AuNPs作为目标样品，以计算其平均直径和尺寸分布。分别测量ZP、DLS 和AuNPs 的浓度，且每个样品扫描6 次并计算平均值。

1.2.3 纳米颗粒抑制作用的研究 分别使用NP1-NP4 进行β-GAL 催化水解CPRG 底物的活性滴定。 研究使用0.5 nM β-GAL 进行，该浓度为比色法提供了合理的反应时间（约10 min）。 在实验中，将磷酸盐缓冲溶液（5 mM，pH 7.4）中的β-GAL 与各种浓度的NP1-NP4 一同温育15 min，然后将1.5 mM CPRG（最大值= 595 nm）加入到NP-酶复合物中，从而进行抑制作用的优化实验，选择最佳的NP 配体。

1.2.4 溶液体系中细菌的检测 在比色装置的研究初期，使用大肠杆菌（XL1）作为模型分析物。 在初步的液体反应条件研究中， 可以区分菌体浓度水平低至102CFU/mL （每个样本平行样为3 个，且进行了3 次重复实验）。每个浓度不仅可以通过强度曲线和Vmax直方图来识别， 还可以通过肉眼可见的颜色变化来识别，在显色反应（10 min）后立即拍摄的图像显示了这一色度效果。 随后用革兰氏阳性菌灰色链霉菌和枯草芽孢杆菌观察到Vmax的类似变化。

1.2.5 微斑试纸条的制备 首先， 需要确定添加β-半乳糖苷酶与显色底物CPRG 的最适含量。 在磷酸钠缓冲液（5 mM，pH 7.4）中制备了纳米颗粒和β-GAL 溶液。在活性测定中，β-GAL（0.5 nM)与不同浓度的NP1-NP4 孵育30 min， 加入1.5 mM的显色底物， 并对β-GAL 的酶活性进行了检测。在200 μL β-GAL/AuNPs 溶 液 中 加 入5 μL 的CPRG（PB 缓冲液1.5 mm，5 μL），在预先确定的时间内进行相关的抑制研究。通过活性/抑制研究，得到了β-GAL/ AuNP 配合物的最佳浓度， 确定了β-GAL/AuNP 复合物的不同抑制特性后， 用β-GAL 和NP1-NP4 的化学计量比对细菌进行测定。

1.2.6 微斑试纸条的性能测试 为了测试本研究在试纸条上的性能， 在pH 7.4 的GF/B 滤纸上添加了3 μL 的CPRG （25 mM）、 复合溶液和含有108～103CFU/mL 的大肠杆菌（XL1）菌液。 10 min后，用扫描仪进行显色图像的获取。 并用Image J图像软件进行RGB 通道的平均灰度值的分析。

2 结果与分析

2.1 AuNPs 的特性分析 计算ζ-势（ZP）和动态光散射（DLS），结果用于表征纳米颗粒和蛋白质的电荷与流体动力学直径DH （Zhang 等，2013；Zheng 等，2012；Zhang 等，2010）。将阳离子金纳米颗粒溶解在磷酸盐缓冲液（5 mM，pH 7.4）中以制备5 μM 的溶液。 用透射电子显微镜从200 粒纳米粒子中测定了金属核的平均尺寸， 用“平均直径±标准差”表示。 在pH 7.4、5 mM 磷酸盐缓冲液中测定Zeta 电位。NP1-NP4 相关的表征数据测量结果如表1 所示。

表1 4 种纳米颗粒的表征测量结果

2.2 纳米颗粒抑制作用的分析 将标准化的一级生色底物水解速率（Vmax）相对于NP/β-GAL 摩尔比进行作图，以NP2 为例，在加入NP 后明显降低（图1）。 在活性/抑制研究中，得到了β-Gal/AuNP配合物的最佳浓度β-GAL=0.5 nM 时，纳米粒子最适匹配量分别为NP1： 12 nM；NP2： 6 nM；NP3： 9 nM；NP4： 35 nM。 最终选择NP2 作为最高亲和力的酶抑制剂， 因为其在非常低的浓度下即可抑制β-GAL 活性并提供最低的LOD（图2）。

图1 加入NP2 后，对β-GAL 的抑制作用

图2 不同纳米颗粒NP 对LOD值的影响

本研究中， 含AuNP 的溶液各实验前均新鲜制备酶复合物， 在实验过程中和实验后均未观察到明显的沉淀或颜色变化。作为对照组，实验研究了经过中性纳米粒子NPTEG和负纳米粒子NPCO2所功能化后对酶的抑制作用， 未见抑制作用的发生（图3）。几种酶-纳米复合传感器（β-GAL/NP2）对不同细菌浓度孵育的动力学吸光度的变化。 在嵌入体中，NPCO2和NPTEG是负的和中性的纳米粒子，没有观察到相互作用。 以细菌（E.coli XL1）以及β-GAL 与底物进行对照， 可观察到溶液中颜色的变化。为作对照实验，又研究了NPCO2和NPTEG纳米粒子、 细菌和α-GAL 在CPRG 溶液中的作用，并与NP2 作比较，没有观察到任何活性或显色反应， 说明此检测方法只是由于酶对底物的水解所致。由图4 可知，溶液相中革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的比色反应显示出， 三种致病菌浓度的变化率变化过程相似。 所以该检测方法具有一定的广谱性。

图3 不同纳米颗粒对细菌抑制作用

图4 广谱性分析

2.3 试纸条的制备与优化 为了可在现场即时快速检测，实验继而进行了微斑试纸条的制备。 这种检测手段的关键问题是怎样能够产生快速且可重复操作。 而不同材料的纸张对于不同检测方法的作用是不同的。 因此，实验广泛试用了各种可用材料， 以保证酶的活性和效率不变以及酶的抑制和活性恢复过程的有效进行。 在测试材料中，最终确定选用GF/B 无粘结微纤维滤纸作为检测装置的载体，具有湿强度高、承载能力强、响应快等特点。 经过相关的优化实验， 确定了在比色试纸条中分别滴加25 mM CPRG 和15 nM β-GAL，可在10 min内发生显色反应。 随后在相关抑制作用的研究中NPTEG和NPCO2作为对照，未观察到抑制作用。 最终确定将β-GAL（15 nM）与NP2（80 nM）混合，使复合材料干燥15 min，最终生成NP2 配合物。在检测装置内分别滴加25 mM CPRG 和15 nM β-GAL，使反应以适当的速度进行， 使底物的颜色在预定的时间内（即10 min）由黄色变为暗红色。

图5 大肠杆菌的可视化检测

2.4 水中大肠杆菌的可视化检测 以大肠杆菌XL1 为例，进行实际样品的可视化测试实验。 如图5 所示， 在103CFU/mL 浓度范围内可以观察到明显的视觉差异。为了对微斑试纸进行定量评价， 对图像的RGB 谱图进行了分析。 图5 中的RGB 比色通道图（n=4）确定了显色反应的有效性， 通过不同颜色通道下平均灰度值的计算，得到不同趋势的分析结果，但都可分别进行相关的定量分析。 最终确定该方法可检测出103CFU/mL 的菌体浓度。

3 结论

基于酶-纳米颗粒结合，提供快速、灵敏的致病菌比色试纸条。 通过NP 的优化最终确定了NP2 为配体头基， 该系统不仅可以在溶液体系内反应， 实验又将这一方法转换成可视化微斑测试条模式， 为现场即时快速检测提供了一种潜在的分析手段。 目前，针对大肠杆菌（XL1）模型进行检测，其灵敏度为103CFU/mL，但不同致病菌的检测灵敏度可能因种而异。 未来将向多重快速检测的方向发展， 以期在提高装置灵敏度的同时可进行多种致病菌的同时检测并可定量分析。