纤维素酶和木聚糖酶协同降解葡萄皮渣条件优化

索江华， 唐桂芬， 连艳鲜

（河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，河南郑州450046）

葡萄皮渣是酿造葡萄酒的副产品， 其除了含有常规的营养成分外，还含有丰富的功能成分，对动物具有特殊作用， 如对肠道菌群具有很好的调节作用（Feng，2019）；抗氧化作用；降低甘油三酯和极低密度脂蛋白含量（Yu，2019）；改善鱼、肉的品质（Aditya，2018）等。 但因为其粗纤维含量高，大大降低了其利用率和适口性， 为了能有效提高葡萄皮渣的利用率， 本文通过纤维素酶和木聚糖酶协同作用， 利用响应面优化法设计和筛选最佳降解葡萄皮渣工艺。

1 材料与方法

1.1 材料 葡萄皮渣：唐僧寺酒堡提供的赤霞珠酿酒副产品，105 ℃烘至恒重，干物质过40 目筛。

1.2 试剂 0.5 mol/L 盐酸溶液：4.17 mL 的浓盐酸加100 mL 的蒸馏水；10.0 mg/mL 葡萄糖标准溶液： 称取105 ℃烘至恒重的无水葡萄糖约1 g，精确至0.0001 g，加柠檬酸盐缓冲溶液溶解，定容至100 mL。 DNS 试剂： 称取3，5-二硝基水杨酸3.15 g，加水500 mL 搅拌溶解，水浴至45 ℃，然后逐步加入氢氧化钠溶液（200 g/L）、四水酒石酸钾钠91.00 g、苯酚2.50 g 和无水亚硫酸钠2.50 g，搅拌至溶解，冷却至室温后，定容至1000 mL。 过滤，取滤液贮存于棕色瓶中，避光保存。 室温下存放7 d 后可以使用，有效期为6 个月。

1.3 仪器 紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科仪器有限公司；A2201 纤维分析仪，北京伦华科技有限公司。

1.4 葡萄糖标准曲线的绘制 分别量取葡萄糖标准溶液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，分别用柠檬酸缓冲溶液定容至50 mL， 配成浓度为0.00 ～2.00 mg/mL 的葡萄糖标准系列。 分别吸取葡萄糖标准溶液各1.00 mL 于25 mL 具塞比色管中，分别加入2.00 mL 水和2.00 mL DNS 试剂，沸水浴5 min。 冷却至室温， 用水定容至25 mL，在540 nm 波长下比色，以吸光度作横坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为纵坐标， 列出直线回归方程。

1.5 单因素试验设计

1.5.1 酶浓度比例对降解葡萄皮渣生成还原糖的影响 称取0.32 g/L 的葡萄皮渣样品， 依次加入pH 4.8 的缓冲溶液1.00 mL， 并分别加入纤维素酶和木聚糖酶配比（g/L）为3：6、4：5、5：4、6：3、7：2的酶液0.50 mL 于50 ℃的水浴锅中保温1 h，并设平行对照三组， 采用DNS 法得出还原糖含量，确定最适的纤维素酶和木聚糖酶的配比。

1.5.2 反应温度对酶降解葡萄皮渣生成还原糖的影响 称取0.32 g/L 的葡萄皮渣样品， 依次加入pH 为4.0 的缓冲溶液1.0 mL、纤维素酶和木聚糖酶配比为5：4 的酶液0.50 mL 分别于50、55、60、65、70 ℃的水浴锅中保温1 h， 并设平行对照三组，采用DNS 法得出还原糖含量，确定最适反应温度。

1.5.3 pH 对酶降解葡萄皮渣生成还原糖的影响称取0.32 g/L 的葡萄皮渣样品， 依次加入pH 为2.4、3.2、4.0、4.8、5.6 的缓冲溶液1.0 mL、 纤维素酶和木聚糖酶配比为5：4 的酶液0.50 mL 于50 ℃的水浴锅中保温1 h，设平行对照三组，采用DNS法得出还原糖含量，确定最适pH。

1.5.4 反应时间对酶降解葡萄皮渣生成还原糖的影响 称取0.32 g/L 的葡萄皮渣样品， 依次加入pH 为4.0 的缓冲溶液1.0 mL、纤维素酶和木聚糖酶配比为5：4 的酶液0.50 mL 于50 ℃的水浴锅中分别保温1、6、12、18、24 h，并设空白对照和平行对照，采用DNS 法得出还原糖含量，确定最适反应时间。

1.6 响应面法对酶降解葡萄皮渣影响因素的优化 在单因素试验的基础上， 采用Box-Behnken响应面设计， 进行四因素三水平的响应面优化试验，确定最优方案（赵薇等，2019）。 如表1。

表1 响应面优化试验因素与水平

1.7 粗纤维的测定 根据GB/T 6434－2006 采用过滤法测定粗纤维含量（余水宾，2004）。

2 试验结果与分析

2.1 标准曲线的建立 根据葡萄糖标准曲线建立方法， 得出吸光度值与葡萄糖含量线性关系如图1。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 酶浓度比例对降解葡萄皮渣生成还原糖的影响 如图2 可知，不加酶时的还原糖量较低，在纤维素酶加入量小于木聚糖酶时， 葡萄皮渣的还原糖量随纤维素酶的增加而增加， 当增加到一定程度时又缓慢下降。 当纤维素酶的添加量大于木聚糖酶，且纤维素酶和木聚糖酶的比例为5：4 时，葡萄皮渣的还原糖含量达到最高。

图2 酶浓度比例对还原糖含量的影响

2.3 反应温度对酶降解葡萄皮渣生成还原糖的影响 如图3 可知，随着温度的不断增加，葡萄皮渣的还原糖含量也随之增加， 当温度达到60 ℃后， 皮渣的还原糖量开始下降。 因此， 当温度为60 ℃处理葡萄皮渣时得到的还原糖含量最高。

图3 反应温度对还原糖含量的影响

2.4 pH 对酶降解葡萄皮渣生成还原糖的影响由图4 可知，还原糖含量随着pH 的增大而增高，当pH 到4.0 时，还原糖开始下降，说明pH 过高会抑制复合酶的酶活， 从而影响葡萄皮渣还原糖的含量。 因此，在pH 为4.0 时，还原糖有一个波峰，含量达到最高。

2.5 反应时间对酶降解葡萄皮渣生成还原糖的影响 由图5 可知，当反应时间增大时，葡萄皮渣的还原糖也随之缓慢的增加。 但增加到一定程度之后，还原糖的含量开始下降。在反应时间为12 h，还原糖的含量达到一个峰值。相对来说，反应时间对还原糖的影响不太大，数据波动不明显。还原糖含量下降可能是因为随着时间的延长， 还原糖发生氧化还原反应而使其总含量降低。

图4 pH 对还原糖含量的影响

图5 反应时间对还原糖含量的影响

2.6 纤维素酶和木聚糖酶降解葡萄皮渣的试验条件优化

2.6.1 模型的建立和方差分析 根据影响酶降解葡萄皮渣单因素分析的结果， 选择纤维素酶和木聚糖酶浓度比例（A）、反应温度（B）、pH（C）、反应时间（D）为交互因素，根据表1 设计试验，试验方案及结果如表2。

利用design expert 8.0.6 软件对表2 的数据进行多元回归拟合处理， 获得葡萄皮渣中以还原糖含量（Y）为响应值的二次多项回归方程如下：Y =-1391.49394 +68.53724A +29.65128B +240.86850C+7.36340D-0.17243AB-4.31021AC-0.052222AD -1.17552BC +0.059563BD +0.10777CD-14.48531A2-0.20295B2-20.85869C2-0.42437D2，回归方程的方差分析结果见表3。

由表3 可知，上述二次回归模型极显著（P ＜0.01）；模型的调整系数R2=0.9106，该模型能解释91.06%响应值的变化。 Radj2=0.8213，因该模型拟合程度比较好，试验误差小，可以用该模型对葡萄皮渣还原糖含量进行分析和预测。 由方差分析可知，两因素B、D 以及二次项C2、D2对响应值影响极为显著；交互项BC 对响应值影响微显著；因素A、C 与交互项AB、AC、AD、BD、CD 对响应值影响不显著； 说明4 个因素在取值范围内对还原糖影响顺序为C＞D＞B＞A， 即pH＞时间＞温度＞酶浓度比例。

表2 响应面试验设计及结果

2.6.2 响应面3D 曲面分析 由图6 可见， 曲面的倾斜度高， 即坡度陡， 说明复合酶浓度比例和pH 这两个因素的交互作用极显著。在酶浓度比例越接近1.4，pH 越接近4.0 h， 所得的还原糖含量越高，即接近等高线中最小椭圆圆心。

图7 曲面的倾斜度较高，坡度较陡，说明反应温度和pH 这两个因素的交互作用较显著。 在pH接近4.0， 反应温度接近60 ℃时得出的还原糖趋于最高值，即接近等高线中最小椭圆的圆心。

表3 回归模型分析结果

图6 复合酶添加浓度比例和pH对还原糖含量的影响

图7 反应温度和pH 对还原糖含量的影响

图8 曲面的倾斜度高，坡度陡，说明反应时间和pH 这两个因素的交互作用极显著。在pH 越接近4.0， 反应时间越接近12 h 时得出的还原糖趋于最高值，即接近等高线中最小椭圆的圆心。

图8 反应时间和pH 对还原糖含量的影响

图9 曲面的倾斜度一方较高，坡度较陡，说明反应温度和复合酶添加比例这两个因素的交互作用较显著。 在复合酶添加比例接近7：5，反应温度为60 ℃时得出的还原糖趋于最高值，即接近等高线中最小椭圆的圆心。

图9 复合酶添加比例和温度对还原糖含量的影响

图10 曲面的倾斜度较平缓，坡度较缓，说明复合酶添加比例和时间这两个因素的交互作用不太显著。 在复合酶添加比例接近7：5，反应时间为12 h 时得出的还原糖趋于最高值，即接近等高线中最小椭圆的圆心。

图10 复合酶添加比例和时间对还原糖含量的影响

图11 曲面的倾斜度平缓，坡度较缓，说明反应温度和反应时间这两个因素的交互作用较显著。 在反应时间接近12 h、反应温度为60 ℃时得出的还原糖趋于最高值， 即接近等高线中最小椭圆的圆心。

图11 反应温度和反应时间对还原糖含量的影响

通过响应面的分析， 可以得出降解葡萄皮渣产生还原糖最佳工艺为：纤维素酶：木聚糖酶的添加比例为7：5、反应温度60 ℃、pH 4.0、反应时间12 h。

2.6.3 验证试验 为验证响应面设计的可靠性，将上述最佳条件组合进行试验， 即称取一定量的葡萄皮渣，在pH 4.0 的缓冲溶液下润湿，加入比例为7：5 的纤维素酶和木聚糖酶混合溶液，在60℃的水浴锅内反应12 h，在波长540 nm 下测其吸光度，试验平行三次。 结果表明，提取的葡萄皮渣中还原糖的含量达到110.66 mg/L，与预测值相差1.9%左右。 表明响应面所得的最佳组合适用于葡萄皮渣产生还原糖，试验可行。

3 结论

本试验先通过单因素试验对影响纤维素酶和木聚糖酶组成的复合酶降解葡萄皮渣效果做了探究，初步找到了单因素的最适条件为：pH 4.0，温度60 ℃，时间12 h，纤维素酶和木聚糖酶比例5：4。又通过响应面分析试验得出最适条件组合为：pH 4.0，温度60 ℃，纤维素酶和木聚糖酶比例7：5，在此条件下，对0.32 g/L 的葡萄皮渣降解12 h，此时所得的还原糖最高为110.66 mg/L，与不加酶还原糖量76.63 mg/L 提高了44.4%，差异显著。