干扰Twist表达对肾癌细胞糖酵解水平的影响

肖正红，谢广伦，翟焕阁，王苏芳

1)南阳南石医院肿瘤内科 河南南阳 473065 2)郑州大学附属肿瘤医院疼痛科 郑州450008

肾癌是一种发展速度快、早期临床症状不明显的常见恶性肿瘤，其发病机制较为复杂，多种基因在肾癌发展中发挥重要作用[1]。基因靶向治疗已经成为肾癌治疗的有效途径[2]。不同于正常细胞，有氧糖酵解是肿瘤细胞特有的能量供应方式，无论是有氧还是乏氧条件下肿瘤细胞均以糖酵解为主要代谢途径，研究肿瘤细胞糖酵解机制对于阐明肿瘤发病机制具有重要意义[3]。Twist是一个转录调控因子，在胚胎发育中发挥重要作用[4]。目前的研究[5-7]显示，Twist是一种癌基因，在多种肿瘤组织如肾癌、胃癌、宫颈癌等组织中高表达，敲低其表达可以抑制多种肿瘤细胞的生长。已经证实Twist具有促进乳腺癌细胞能量代谢的作用[3]。己糖激酶2(HK2)和丙酮酸激酶M2亚型(PKM2)是糖酵解途径中的关键限速酶。本实验利用shRNA技术下调肾癌细胞A498中Twist的表达，观察细胞增殖活性，细胞中糖酵解关键酶PKM2、HK2表达水平及糖酵解代谢水平的变化，为阐明肾癌分子发病机制及靶向Twist治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1细胞来源及主要试剂、仪器A498购自美国ATCC，细胞用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养，在培养液中添加青、链霉素。ATP含量检测试剂盒、乳酸含量检测试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司，葡萄糖含量检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Twist shRNA(序列为GCGCTAGAATGTACTCGTTAC)和阴性对照(shRNA-NC)由北京百奥川生物科技有限责任公司合成,将shRNA序列载入pGPU6-GFP-Neo表达载体, 构建pGPU6-Twist-GFP-Neo慢病毒和阴性对照慢病毒；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒购自大连TaKaRa公司； Twist抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology，HK2、PKM2抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗兔IgG)购自上海容创生物技术有限公司；MTT检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2实验分组将A498细胞分成3组：Twist shRNA、shRNA-NC、空白对照组。Twist shRNA、shRNA-NC组细胞分别稳定感染Twist shRNA慢病毒和shRNA-NC慢病毒，空白对照组不做慢病毒感染。A498培养至细胞密度约为30%时，添加病毒液(MOI=20)，继续孵育10 h后，吸弃上清，添加细胞培养液，培养3 d后，于荧光显微镜下观察绿色荧光水平。用嘌呤霉素筛选细胞，检测细胞中Twist mRNA 和蛋白的表达，以评估沉默效果。

1.3细胞中Twist mRNA 和蛋白表达的检测①qRT-PCR：Trizol法提取细胞总RNA，操作同试剂说明书。取0.5 μg总RNA进行反转录，反转录条件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃10 min。PCR引物：Twist 正义链 5’-GTGGACAGTGATTCCCAGACGG-3’，反义链 5’-CAGTGGCTGATTGGCACGACCT-3’；GAPDH正义链 5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAG CAGG-3’，反义链 5’-AAAGGTGGAGGAGTGGGT GTCG-3’。引物均由上海英骏公司合成。PCR反应条件为95 ℃10 s；95 ℃10 s，58 ℃30 s，共循环40次。以未加细胞的培养液为对照。Twist mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。②Western blot：提取细胞总蛋白，经BCA法检测浓度后，行SDS-PAGE，将蛋白转至NC膜，于50 g/L牛血清白蛋白封闭液中室温放置1.5 h。再将NC膜置于含有一抗(Twist抗体以1∶400稀释，GAPDH抗体以1∶1 000稀释)的平皿内，4 ℃过夜，再于二抗(以1∶3 000稀释)孵育液中室温反应2 h，ECL发光。利用Quantity One软件统计条带灰度值，以Twist与GAPDH条带灰度值的比值表示Twist蛋白表达水平。实验重复3次。

1.4MTT法检测细胞增殖分别取3组细胞接种到96孔板内，每孔104个，培养48 h后，每孔中加入20 μL的MTT溶液孵育4 h，去上清，添加150 μL的DMSO，10 min后用酶标仪检测490 nm处的光密度。细胞存活率=实验组光密度值/培养液对照光密度值×100%。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.5平板克隆实验检测细胞克隆形成能力分别取3组细胞，配制成2 000个/mL的悬液，吸取100 μL到60 mm培养皿内，加5 mL细胞培养液培养,每2 d换液1次。14 d后，用PBS洗涤细胞2次，甲醇固定，吉姆萨染色，于显微镜下观察，计数>50个细胞的集落。克隆形成率=(集落数/接种细胞数)×100%。

1.6Western blot法检测细胞中HK2和PKM2蛋白的表达细胞分组培养48 h后，用Western blot法检测细胞中HK2和PKM2蛋白表达水平，操作同1.3，HK2和PKM2一抗以1∶400稀释。

1.7乳酸分泌水平、ATP含量和葡萄糖消耗量的检测分组培养48 h后，分别收集3组细胞的培养上清，3 500 r/min离心5 min，收集上清。用乳酸脱氢酶比色法检测上清中乳酸含量;用葡萄糖氧化酶法检测上清中葡萄糖含量，并以培养液对照中的葡萄糖含量与各实验组上清中葡萄糖含量的差值表示葡萄糖消耗量；用比色法检测ATP含量。具体操作均按照试剂盒说明进行。

1.8统计学处理实验数据用SPSS21.0分析，3组Twist mRNA，Twist、PKM2、HK2蛋白表达水平，细胞存活率，克隆形成率，ATP含量，乳酸分泌水平及葡萄糖消耗量的比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组细胞中Twist表达水平的比较Western blot结果见图1、表1。Twist shRNA组细胞Twist mRNA和蛋白表达水平均低于空白对照组和shRNA-NC组。

1、2、3：分别为空白对照组、shRNA-NC组、Twist shRNA组

组别nTwist mRNATwist 蛋白空白对照组31.00±0.110.45±0.06shRNA-NC组31.01±0.120.43±0.07Twist shRNA组30.36±0.04∗0.14±0.03∗F44.42428.819P<0.0010.001

*：与空白对照组和shRNA-NC组比较，P<0.05

2.2 3组细胞存活率和克隆形成率的比较见表2。Twist shRNA组细胞存活率和克隆形成率均低于空白对照组和shRNA-NC组。

表2 3组细胞存活率和克隆形成率的比较

*：与空白对照组和shRNA-NC组比较，P<0.05

2.3 3组细胞中PKM2、HK2蛋白表达水平的比较见图2和表3。Twist shRNA组细胞中PKM2、HK2蛋白表达水平均低于空白对照组和shRNA-NC组。

1、2、3：分别为空白对照组、shRNA-NC组、Twist shRNA组

组别nPKM2HK2空白对照组30.36±0.040.68±0.08shRNA-NC组30.35±0.060.67±0.05Twist shRNA组30.19±0.02∗0.14±0.03∗F14.62587.643P0.005<0.001

*：与空白对照组和shRNA-NC组比较，P<0.05

2.4 3组细胞培养上清中ATP含量、乳酸分泌水平及葡萄糖消耗量的比较见表4。Twist shRNA组细胞中ATP含量、乳酸分泌水平及葡萄糖消耗量均较空白对照组和shRNA-NC组降低。

表4 3组细胞培养上清中ATP含量、乳酸分泌水平及葡萄糖消耗量的比较μmol/L

组别nATP含量乳酸分泌水平葡萄糖消耗量空白对照组3147.23±11.2512.85±1.145.17±0.65shRNA-NC组3145.02±13.2013.04±1.265.23±0.52Twist shRNA组394.12±10.51∗8.15±0.71∗3.15±0.20∗F19.75520.36317.213P0.0020.0020.003

*：与空白对照组和shRNA-NC组比较，P<0.05

3 讨论

Twist属于螺-环-螺转录因子蛋白家族成员，是一个进化十分保守的转录调控因子[8]。Twist在内胚层来源的细胞和组织中表达，在成人心脏、骨骼肌、胰腺、肾脏及胎盘等组织中表达，在脑组织中几乎不表达[9]。随着研究的进展，人们发现，Twist在乳腺癌、肝癌、宫颈癌等多种类型的癌组织中表达水平升高[10-12]，参与肿瘤细胞生长的调控。敲低Twist可以体外抑制宫颈癌、食管癌等肿瘤细胞的生长，并且可以抑制结肠癌、胃癌等细胞在裸鼠体内的成瘤能力[13-15]。已有研究[16]显示，Twist表达水平升高与肾癌恶性进展关系密切。本实验结果显示，下调Twist表达后，肾癌细胞的存活能力和克隆形成能力均降低，Twist在肾癌中可能发挥癌基因的作用。

肿瘤细胞在氧气充足条件下仍然优先以有氧糖酵解为主要供能方式，这种现象称为Warburg效应，Warburg效应也被认为是肿瘤细胞的重要特征之一[17-18]。PKM2、HK2是糖酵解途径中的关键限速酶，二者在肿瘤细胞中的表达水平升高，能够促进糖酵解，为肿瘤细胞的生长提供ATP[19]。Twist作为一种癌基因，不仅与肿瘤细胞的生长有关，还与肿瘤细胞的糖酵解过程有关。Twist可以诱导乳腺癌细胞中PKM2的表达，促进乳腺癌细胞的代谢途径从氧化磷酸化向糖酵解转变，诱导乳腺癌细胞重塑能量代谢途径[3,20]。乳酸是糖酵解产物之一，其可以被分泌至细胞外，检测培养上清中乳酸含量可以间接反应细胞糖酵解水平[21-22]。本实验结果显示，下调Twist后肾癌细胞中PKM2、HK2蛋白的表达降低，ATP含量下降，乳酸分泌水平和葡萄糖消耗量下降，说明下调Twist能够降低糖酵解关键酶的表达，抑制肾癌细胞有氧糖酵解水平。

总而言之，下调Twist可能通过抑制肾癌细胞中糖酵解关键酶的表达，减少细胞合成ATP，从而抑制肾癌细胞生长。本实验结果为靶向Twist治疗肾癌提供了参考依据。