葱兰愈伤组织诱导及植株再生

熊 琴，付素静，鲁万贵

（1.铜仁学院 农林工程与规划学院，贵州 铜仁 554300；2.铜仁市万山区鱼塘侗族苗族乡初级中学，贵州 铜仁 554300；3.铜仁市园林局，贵州 铜仁 554300）

葱兰［Zephyranthes candida（Lindl.）Herb.］，又叫葱莲、玉莲、白花菖蒲莲，为石蒜科葱兰属多年生常绿草本植物，植株高20～35 cm，7—11月开花，花期较长。花茎从叶丛中抽出，高出叶端，顶生一白色花，花径2～3 cm，花瓣6，果期9—10月[1]，原产自南美洲。

葱兰株丛低矮、终年常绿、花朵繁多、花期长，是花境、花坛的镶边材料，也可用于林下、边缘或半阴处，作园林地被植物[1]。目前，对葱兰的研究主要集中在病虫害的防治、抗性[2-4]等方面。葱兰主要靠播种和分株繁殖，其种子易掉落，不易采收[1，5]，加之分株繁殖的繁殖系数低，难以规模化育苗，从而，难以满足日益增长的园林绿化需求。组织培养可以快速获得大量种苗，弥补常规种子繁殖和分株繁殖繁殖系数低的缺陷。此外，用种子作为外植体还可获得无病毒的植株。葱兰的组织培养，可追溯到1992年，陈扬春[6]用鳞片作为外植体建立了葱兰的无菌体系，第一次获得了葱兰无菌植株。其后，邓祖丽颖等[7]分别用叶片、鳞叶和顶芽等作为外植体，建立了高效的再生体系。本研究采用葱兰种子作为外植体建立无菌体系，探讨其愈伤组织、丛生芽诱导的最佳培养基，旨在保留葱兰有性繁殖特征的同时，也可以快速获得大量健康种苗，从而为葱兰大规模生产提供技术指导，并为葱兰的园林应用提供保障。

1 材料和方法

1.1 材料

实验所用葱兰种子采于铜仁学院，经过人工授粉后所得。

1.2 方法

1.2.1 培养基的设计与制作 本试验基本培养基为MS，研究不同浓度的2，4-D、6-BA 和NAA 组合对葱兰愈伤组织及丛生芽的影响，组合设计见表1。每种培养基设置30 个重复处理，由于污染造成的重复数量不足的培养基补足至30 个。

表1 培养基的设计

1.2.2 外植体的消毒与接种 用流水冲洗葱兰种子2 h。在超净工作台上，首先用75%酒精对种子消毒30 s，然后用无菌水冲洗3～4 次，用无菌滤纸吸干水分，再用含氯1%～2%的次氯酸钠溶液消毒20 min，最后放入无菌水中漂洗3～4 次，把消毒好的葱兰种子放在无菌纸上，吸干水分后接种到培养基。每种培养基接种30 瓶，每瓶内接种种子4～5 颗。继代或丛生芽诱导培养每支试管内接种1 块愈伤组织，大小为0.5 cm×0.5 cm。

1.2.3 培养条件与观察 培养条件为温度（25±2）℃，光照时间12 h/d，光照强度3 000 lx。接种后30 d 观察培养基中葱兰的生长情况并记录。

各培养基中均添加蔗糖30.0 g/L，琼脂粉6.5 g/L，pH 值5.8 左右，培养基配制好后在121 ℃下灭菌20 min。

1.3 数据统计与分析

实验数据采用Excel 2010 整理，SPSS 21.0 进行方差分析，Duncan 法进行差异显著性检验。愈伤组织诱导率、不定芽诱导率、丛生芽增殖系数的计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 不同浓度激素及其组合对葱兰种子愈伤组织诱导的影响

由表2可知，不同浓度激素及其组合对葱兰种子愈伤组织诱导效果存在很大不同。在处理1 培养基中外植体褐化死亡，未生长出白色愈伤组织。增加2，4-D浓度后在处理2 培养基中只有1 瓶长出颗粒状的白色愈伤组织，但30 d 后褐化死亡，其愈伤组织诱导率仅为3.3%，说明2，4-D 对愈伤组织的诱导有一定的作用，但是单独的2，4-D 低浓度处理对葱兰种子愈伤组织诱导作用不明显，需与其他激素配合使用。

在复合了6-BA 的处理3 培养基（MS+2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L） 中长出了白色愈伤组织，愈伤组织诱导率达70.0%，且部分愈伤组织上分化出了茎叶，但在继代培养基中愈伤组织逐渐褐化死亡。同时增加两种激素的浓度后，在处理4培养基（MS+2，4-D 0.2 mg/L+6-BA 0.4 mg/L）上诱导出了白色愈伤组织，愈伤组织诱导率达86.7%，且长出了绿色的叶子，连续继代培养后，虽仍有白色愈伤组织，但一段时间后逐渐变黄、死亡。在继续增加2，4-D 浓度、降低6-BA 浓度的处理5 培养基（MS+2，4-D 0.4 mg/L+6-BA 0.2 mg/L）上长出白色疏松的愈伤组织（图1），愈伤组织诱导率达90.0%，其中部分分化出芽，长势好，继代培养3 代后，愈伤组织仍具有增殖能力。处理6 培养基中继续增加2，4-D 浓度至1.0 mg/L、6-BA 浓度保持不变（MS+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L），愈伤组织的诱导率提高至93.3%，愈伤组织白色，部分分化出芽，长势好，但是继代培养后，白色愈伤组织增殖缓慢。处理7 培养基中保持6-BA 浓度不变，降低2，4-D 浓度至0.1 mg/L 时（MS+2，4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L），能诱导出白色愈伤组织，诱导率为83.3%，但是愈伤组织易褐化，最终死亡。

各培养基对愈伤组织的诱导率差异显著，其中处理6 培养基诱导率最高，但愈伤组织继代培养后增殖缓慢，综合考虑诱导率及增殖效果，处理5 培养基（MS+2，4-D 0.4 mg/L+6-BA 0.2 mg/L）效果最好。

表2 不同浓度激素及其组合对葱兰种子愈伤组织的诱导结果

图1 葱兰愈伤组织

2.2 不同浓度激素组合对葱兰丛生芽诱导的影响

不同浓度激素组合对葱兰丛生芽的诱导结果见表3。在处理8 培养基（MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L）中的部分愈伤组织长出不定芽，不定芽为淡黄色，诱导率为33.3%，未分化的愈伤组织逐渐褐化；增加6-BA 浓度后，在处理9 培养基（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L）中的愈伤组织多数能分化出芽，不定芽为淡黄色或白色，诱导率为66.7%，且生长状况较好，后期丛生芽长成正常的绿色幼苗（图2）。从丛生芽的增殖系数来看，处理9 培养基中平均每块愈伤组织上诱导出芽的数量也比处理8 培养基增加94.4%。

表3 不同浓度激素组合对葱兰丛生芽的诱导结果

3 结论与讨论

3.1 不同浓度激素及其组合对葱兰愈伤组织的诱导

图2 葱兰幼苗

从实验结果来看，MS+2，4-D 0.1 mg/L 和MS+2，4-D 0.2 mg/L 两个处理对葱兰愈伤组织的诱导有一定的促进作用，但效果不明显，当复合了6-BA 后，葱兰愈伤组织的诱导效果明显提高，愈伤组织诱导率提升至70.0%以上。随着2，4-D 浓度的增加，愈伤组织诱导率逐渐提高，MS+2，4-D 0.4 mg/L+6-BA 0.2 mg/L处理葱兰愈伤组织诱导率达90.0%，愈伤组织白色疏松，部分分化出芽，长势好，继代培养3 代后，愈伤组织仍具有增殖能力。MS+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L 处理葱兰愈伤组织诱导率最高，达93.3%，但其诱导出的愈伤组织继代培养后失去分裂能力，增生很困难。综合认为，在不考虑激素相互作用的前提下确定2，4-D 的最佳浓度为0.4 mg/L，这与邓祖丽颖等[7]的研究结果中2，4-D 适宜浓度1～2 mg/L 相比要低，更显经济。实验结果表明：2，4-D 与6-BA 复合能够有效地诱导葱兰愈伤组织，且部分能够分化出芽，与邓祖丽颖等[7]研究认为该激素组合不能由愈伤组织上分化出芽的结论不同，其原因可能与不同的激素浓度组合效果差异有关。

另外，在处理5 培养基MS+2，4-D 0.4 mg/L+6-BA 0.2 mg/L 中愈伤组织长势最好，长出了白色的芽，且继代培养中仍能保持愈伤组织增殖，这与龚雪琴等[8]在同科植物朱顶红的愈伤组织诱导上的研究结果很相似，该愈伤组织是否为胚性愈伤组织并未做进一步验证，但是，鲁娇娇等[9]研究证明朱顶红胚性愈伤组织的诱导需要TDZ 的参与。以上结果表明，诱导石蒜科植物愈伤组织可以使用激素2，4-D和6-BA 组合，并可通过调节二者的比例找到最适合的激素配方。

3.2 不同浓度激素组合对葱兰丛生芽的诱导

本研究选用了6-BA 与NAA 的激素组合对葱兰愈伤组织进行丛生芽的诱导，增加6-BA 浓度能够提高丛生芽的诱导率，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L 处理丛生芽诱导率为66.7%，丛生芽的增殖系数为3.5，这与邓祖丽颖等[7]对同种激素组合的实验结果相近，与刘铎等[10]对朱顶红的研究结果相近。

3.3 葱兰种子愈伤组织、丛生芽最佳诱导培养基

本研究认为，葱兰种子愈伤组织的最佳诱导培养基为MS+2，4-D 0.4 mg/L+6-BA 0.2 mg/L，丛生芽诱导的最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。通过组织培养的方法，可以满足大规模园林绿化的需求，也丰富了生物技术在园林绿化植物上的应用。

4 展望与不足

用葱兰的种子作为外植体诱导愈伤组织和丛生芽取得了一定的进展，对葱兰大规模的生产具有一定的参考作用，但外植体的来源还不丰富，对丛生芽诱导培养基、胚性愈伤组织的诱导还需进一步优化，对不定根的诱导及幼苗的移栽都有待进一步研究。