披碱草属牧草DNA指纹图谱构建及遗传多样性分析

张 锐，唐艾嘉，解继红，石凤翎，3，4，赵 彦，3，4

（1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古呼和浩特 010011；2.中国农业科学院草原研究所，内蒙古呼和浩特 010010；3.农业农村部饲草栽培加工与高效利用重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；4.草地资源教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）

披碱草属（Elymus）是禾本科（Gramineae）小麦族（Triticeae）内种类最多、分布最广的属，广义的披碱草属包括近150 个种。披碱草属牧草为中生-旱中生多年生优良牧草，是草原和草甸的重要组成部分。披碱草具有抗寒、耐旱、耐碱、抗风沙等特性，是重要的固沙草本植物，也是重要的牧草种质资源，亦可为麦类作物遗传改良提供优异基因资源[1]。遗传多样性是保护生物学研究的核心之一，了解物种遗传变异的大小、时空分布及其与环境条件的关系，有助于采取科学有效的措施来保护人类赖以生存的遗传资源，可为植物的分类进化研究提供有益的资料，进而为植物育种和遗传改良奠定基础[2]。

DNA 指纹图谱是先进的遗传标记系统，具有高分辨率、准确稳定，能够可靠地鉴定出生物个体与群体之间的差异及特点。利用分子标记技术建立DNA指纹图谱对鉴别品种、品系和选择杂交亲本有着重要的意义[3-4]。ISSR（Inter-simple sequence repeat）是一种以PCR 技术为基础的高效分子标记技术，由ZIETKIEWICZ 等[5]在1994年提出可用其来检测SSR间DNA 的序列差异。ISSR 通过利用重复序列加选择性碱基为引物，对基因组DNA 进行扩增，可使其多态性产物更为丰富，因而能够提供更多的遗传信息，此外还具有重复性高、稳定性好等优点。现已应用于分子指纹图谱、居群遗传分析和系统进化等研究[6-8]。SRAP （Sequence-related amplified polymorphism）是由美国加州大学作物系LI 等[9]研究芸薹作物时开发出来的一种新型分子标记系统，它具有简便、重复性好、易于分离条带和测序、成本低等优点。在SRAP标记中，引物的设计是关键，它独特的引物将其可检测基因的开放阅读框（ORF）区域设计成一种无须任何序列信息就能直接进行PCR 扩增。目前，在植物遗传图谱构建[10]、作物遗传多样性分析[11-12]、基因定位[9]及比较基因组学[13]等方面已成功应用。

本研究利用SRAP 和ISSR 分子标记，构建26 份披碱草属植物材料的DNA 指纹图谱并进行遗传多样性分析，从而筛选出适用于鉴定披碱草材料的分子标记，同时获得供试材料的遗传背景信息及各材料间的亲缘关系，以期为披碱草种质资源收集、保护、育种及综合评价研究工作提供资料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究供试材料为26 份披碱草材料，其中包括国家审定登记的披碱草品种、地方品种和代表性的披碱草种质资源（表1）。所有材料均于2017年6月8日采自中国农业科学院草原研究所沙尔沁基地。各材料随机取25 个单株，分别提取单株总基因组DNA，等量混合为DNA 池作为模板保存在-80 ℃超低温冰箱备用。

1.2 DNA 提取与检测

采用天根植物基因组DNA 提取试剂盒提取DNA，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA 的纯度及浓度，满足实验要求，存放于-20 ℃冰箱中备用。

1.3 ISSR 的PCR 扩增和检测

ISSR 扩增反应的总体积为20 μL：2×Taq Master Mix（其组分含有0.1 U/μL Taq DNA Polymerase、2×PCR 反应缓冲液、3 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs）10 μL，DNA 模板1 μL（20～30 ng/μL），引物1 μL（10 ng/μL），ddH2O 8 μL。引物由上海生工合成。PCR 扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共40 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像仪上照相。

1.4 SRAP 的PCR 扩增和检测

SRAP-PCR 反应液体积为20 μL：2×Taq Master Mix （其组分含有0.1 U/μL Taq DNA Polymerase、2×PCR 反应缓冲液、3 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs）10 μL，DNA 模板1 μL，上下引物各加0.5 μL，ddH2O 8 μL，在ABIVERITI 梯度PCR 仪中进行，SRAP 随机引物由上海生工合成。PCR 扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共5 个循环；再94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 扩增产物通过1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像仪上照相。

1.5 数据分析

在ISSR 和SRAP 电泳图谱分析中，挑选比较清晰、重复性较好的条带进行分析，同时将试验中扩增的每一个条带均视为一个条带，然后统计和计算扩增的总条带数及多态性条带数。根据条带的有无分别记为1，0。本试验涉及的材料间的遗传相似系数GS 值，依据Nei-Li 的方法进行计算，其相关的计算公式为：

表1 供试材料

其中，Nij表示供试物种材料i 和j 中所共有的扩增条带的数目，Ni是材料i 中出现的扩增条带的数目，Nj表示材料j 中出现的扩增条带的数目[14]。此外，在分析软件NTSYS 2.1 中，以不同材料间的遗传相似系数GS 值为基础，进行聚类分析[15]。

2 结果与分析

2.1 ISSR 分子标记多态性分析

试验采用ISSR 的分子标记方法对26 份样本筛选出了10 个扩增条带清晰、多态性较好的引物，分别 是UBC807、UBC808、UBC811、UBC818、UBC835、UBC840、UBC844、UBC845、UBC848 和UBC873。由表2可知，10 个引物共扩增出95 个条带，其中，90 个为多态性条带，多态性条带百分率（PPL）为94.74%，平均每个引物扩增出9.5 个条带，9.0 条多态性条带。扩增片段长度集中在250～1 000 bp，扩增的条带数在4～16 个。ISSR 引物UBC848 对供试材料的扩增图谱见图1。该引物共扩增出14 个条带，且均为多态性条带，PPL 值为100%；类似的引物还有UBC807、UBC808、UBC840、UBC844 和UBC873，其扩增的条带也均为多态性条带。

表2 ISSR 引物序列及其扩增结果

图1 引物UBC848 对供试材料的扩增图谱

2.2 SRAP 分子标记多态性分析

利用SRAP 分子标记方法对26 份披碱草材料筛选出了10 对扩增条带清晰、多态性较好的引物，分 别 是 me2 +em13、me3 +em4、me3 +em15、me4 +em13、me4+em14、me4+em16、me9+em12、me9+em14、me9+em15、me10+em1。由表3可知，10 对引物共扩增出110 条清晰条带，平均每对引物扩增的条带数为11 条。其中，多态性条带100 条，所占比率为90.91%，每对引物的平均多态性条带数为10 条扩增出的片段长度在50～400 bp。引物me4+em13 的扩增图谱见图2。

2.3 遗传相似系数与聚类分析

遗传多样性的高低可通过遗传相似系数的大小来表达，种质间遗传相似系数越小，彼此间亲缘关系越远，说明遗传多样性丰富；反之，遗传相似系数越大，彼此间亲缘关系越近，则遗传多样性越低。本研究利用NTSYS 软件，以Dice 遗传相似系数（GS 值）为基础，计算出26 份披碱草属材料间的遗传相似性系数变幅为0.57～0.89，平均值为0.73，种质间亲缘关系远近程度不一，也说明供试披碱草材料间存在较为丰富的遗传多样性。其中，康巴垂穗披碱草和垂穗披碱草（CF025446）间的遗传相似系数GS 值最高（0.893），亲缘关系最近。察北披碱草和垂穗披碱草（CF030026）2 个品种间的遗传相似系数GS 值最低（0.546），亲缘关系最远。

依据遗传相似性系数，采用UPGMA 法对ISSR和SRAP 标记的26 份披碱草材料进行聚类分析（图3）。在GS 为0.67 处将26 份披碱草材料分为4 类。第1 类主要包括10 份披碱草材料：康巴垂穗披碱草、垂穗披碱草（CF025446）、青牧1 号老芒麦、垂穗披碱草（CF030026）、川草2 号老芒麦、青海湟源披碱草、同德老芒麦、⑥DY、农牧老芒麦和垂穗披碱草。其中，3 份来源于青海、2 份来源于四川、2 份来源于吉林、2 份来源于内蒙古、1 份来源于新疆。第2 类包括9 份披碱草材料：紫芒披碱草、圆柱披碱草（DY）、甘南垂穗披碱草、圆柱披碱草（CF016717）、同德短芒披碱草、紫黑披碱草（CF016709）、青海短芒披碱草、紫芒披碱草（CF016976）和四川红原老芒麦。其中，4 份来源于青海、3 份来源于甘肃、2 份来源于四川。第3 类包括5 份披碱草材料：察北披碱草、DY、天山披碱草、新疆伊犁垂穗披碱草和圆柱披碱草。其中，2 份来源于青海、2 份来源于新疆、1 份来源于河北。第4 类包括2 份披碱草材料：紫黑披碱草（CF16711）和紫芒披碱草（CF016977），分别来源于四川和内蒙古，这2 份材料的遗传背景与其他材料存在较大的差异，亲缘关系较远，表现出遗传特异性。

表3 SRAP 引物序列及其扩增结果

图2 引物me4+em13 对供试材料的扩增图谱

2.4 指纹图谱的构建

2.4.1 ISSR 指纹图谱的构建 ISSR 引物UBC818对26 个披碱草材料的扩增结果见图4。由图4可以看出，该引物共扩增出16 个多态性条带，PPL 值为100%，所扩增条带清晰、丰富，且26 份材料分别扩增出的条带互不相同，能够彼此区分，因此将引物UBC818 作为鉴别26 份披碱草材料的分子标记，并建立了披碱草材料ISSR 指纹图谱，其结果见表4。

2.4.2 SRAP 指纹图谱的构建 SRAP 引物me4+em16 对26 个披碱草材料的扩增结果如图5所示，这对引物共扩增出16 个多态性条带，PPL 值为100%，扩增条带清晰、丰富，且26 个样本分别扩增出的条带互不相同，能够彼此区分，因此引物me4+em16 可以作为鉴别这26 份披碱草材料的分子标记，由此用该标记建立了披碱草材料的SRAP指纹图谱，其结果见表5。

图3 26 份披碱草基于遗传相似系数的UPGMA 聚类结果

图4 引物UBC818 对供试材料的扩增图谱

3 讨论

遗传多样性是物种携带遗传信息的总和，反映该生物在特定生存条件下基因的丰富程度，是育种研究工作中最有价值的物质基础，而亲缘关系分析和指纹图谱构建对于品种保护和新品种定向选育具有重要意义[16-17]。ISSR 和SRAP 分子标记技术都具有简便、快速、稳定性和重复性较好等特点，在植物遗传多样性分析和遗传作图中有着广泛的应用。已有研究结果表明[14，18-19]，这些分子标记对披碱草遗传多样性的分析很有成效，本研究结果也证明了这一点。

表4 26 份披碱草材料的ISSR 指纹图谱

图5 引物me4+em16 对供试材料的扩增图谱

多态性百分率是衡量种群间遗传变异情况的重要指标。多态性百分率越高，遗传背景越丰富，适应能力越强，反之则弱。在本研究中，ISSR 和SRAP 标记分别扩增出较高的多态性条带95 条和90 条，多态性条带百分率（PPL）分别为94.74%和90.91%，这说明本研究中的26 份披碱草种质资源的遗传多样性水平比较丰富。郑经红等[14]采用ISSR 技术对25 份西北高原的野生垂穗披碱草种质进行分析，结果显示多态性条带比率为70.8%；陈智华等[20]采用SRAP技术对来自我国四川、西藏、青海、新疆等地的68 份垂穗披碱草种质进行了多态性分析，结果显示多态性条带比率达85.39%。这些研究结果均说明供试披碱草材料具有丰富的遗传多样性。多态性条带比率之所以有这样的差别，原因可能是供试材料种类和来源地有所不同。

表5 26 份披碱草材料的SRAP 指纹图谱

从供试材料的聚类图可以看出，本研究中的供试材料的遗传背景与其地理来源有一定的相关性，但并不是很明显。比如，第1 类主要包括10 份披碱草材料，其中，3 份来源于青海、2 份来源于四川、2 份来源于吉林、2 份来源于内蒙古、1 份来源于新疆。第2 大类中包括9 份披碱草材料，其中，4 份来源于青海、3 份来源于甘肃、2 份来源于四川。两大类材料均集中分布在西北地区。这可能与本研究所用材料大部分来自地域广阔、生境复杂的地区，各地理类群海拔、经纬度、温度、湿度和环境等都有差别，造成了较大的遗传变异[20]。此外，还可能与不同种源材料异地引种选育、推广利用有关，所以从DNA 水平鉴定，兼顾形态特征评价，才能准确鉴定各品种和代表性种质材料，理清各材料的亲缘关系，为种质材料的合理利用提供科学依据。

4 结论

本研究利用ISSR 和SRAP 分子标记对26 份披碱草材料进行了遗传多样性分析，将供试材料聚为4 大类；利用筛选出的ISSR 引物UBC818 以及SRAP 引物me4+em16 构建了DNA 指纹图谱，可用于鉴别26 份供试材料。ISSR 和SRAP 分子标记能够充分揭示披碱草不同品种（种质）间存在的遗传差异，均可用于披碱草种质资源的遗传评价、种质鉴定等研究工作。