全清液发酵营养组学的精准控制

卢宗梅 周勇 杨儒文 刘梦涵 彭超 朱威宇 何太波 佟毅

摘      要：以黑曲霉Co827菌株为试验菌株，在淀粉全清液培养基的基础上，以多尺度手段对培养基中的氮源、磷源对菌株产酸能力的影响进行研究。研究结果表明：黑曲霉Co827以淀粉糖液为碳源的全清液发酵培养基中，生长期（种子罐培养基）的碳氮比为30、氮磷比为3.2，产酸期（发酵罐培养基）的碳氮比为70，氮磷比为3.5。

关  键  詞：全清液;发酵;碳氮比;氮磷比

中图分类号：TQ 921.1       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）04-0830-04

Abstract： Aspergillus Niger Co827 was used as the experimental strain. On the basis of starch clear medium， the effect of nitrogen and phosphorus sources on the acidogenicity of this strain was studied by multi-scale method. The results showed that Aspergillus Niger Co827 was fermented in pure fermentation medium with starch sugar solution as carbon source. During the growth period （seed tank medium）， the ratio of carbon to nitrogen was 30， the ratio of nitrogen to phosphorus was 3.2; the ratio of carbon to nitrogen in the acid-producing period （fermentation tank medium） was 70， and the ratio of nitrogen to phosphorus was 3.5.

Key words：  full clear liquid ; fermentation; carbon nitrogen ratio; N：P ratio

柠檬酸是一种重要的有机酸，又名枸橼酸，是动植物内的一种天然成分和身体代谢的中间产物，也是食品、医药、化工等领域应用最广泛的有机酸之一，广泛应用于工业、食品业和化妆业等领域。它是无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，无臭，有很强的酸味，但令人愉快，稍有涩味。易溶于水，在温暖空气中渐渐风化，在潮湿空气中微有潮解性。柠檬酸晶体有两种，36 ℃以上结晶出来不含结晶水的为无水柠檬酸，36 ℃以下结晶出来带有一个结晶水的为一水柠檬酸[1]。

目前，柠檬酸生产中基本采用的都是玉米粉液化液加过滤清液的粗犷发酵控制方式。由于培养基营养成分由玉米粉液化液提供，其中成分复杂且波动大，生产不易控制。因此，为了实现发酵过程的精准控制，通过开发全清液培养基并实现营养组学的精准控制，氮源和磷源是其中最为重要的两种营养。

氮源分为有机氮源和无机氮源，黑曲霉可以利用很多无机和有机氮源，尤其偏好于无机氮源[2]。并且在发酵柠檬酸中途添加NH+4盐也有优越性。国内对玉米粉柠檬酸发酵研究已经非常成熟。研究柠檬酸发酵氮源种类的有很多。以薯干粉为原料发酵生产柠檬酸和以玉米粉液化滤液为基料，添加玉米粉调整氮源发酵生产柠檬酸，培养基中蛋白质含量与产酸情况的研究[3]。添加适量的有机氮源对柠檬酸产量具有促进作用[4]。玉米粉柠檬酸发酵中液化条件影响糖液中溶磷水平，对柠檬酸发酵高产酸非常重要[5]。然而，在全清液柠檬酸发酵的研究过程中，并没有对氮磷的精准控制进行系统和深入的研究。

本文以淀粉全清液柠檬酸发酵培养基为基础，对碳氮磷的关系进行研究，从而达到柠檬酸发酵营养的精准控制，提高发酵水平。

1  实验部分

1.1 材料

1.1.1  材料

供试验菌种：黑曲霉（Aspergillus niger）Co827，由中粮生物化学（安徽）股份有限公司提供。

淀粉：普通商品淀粉，由中粮生物能源（榆树）有限公司提供。

玉米粉、a-耐高温淀粉酶、糖化酶等均由中粮生物化学（安徽）股份有限公司提供。

1.1.2  设备与仪器

高百特全自动5 L发酵罐、金怡牌HH-S2数显恒温水浴锅、金怡牌JJ-1増力电动搅拌器;电子调温电炉;美国Extrel公司MAX300-LG质谱仪高精度尾气在线快速分析系统、INNOVA摇床、1 000 mL烧杯、250 mL三角瓶。

1.1.3  培养基

商品淀粉加水调浆至20%浓度，调整pH至5.7，添加a-淀粉酶加热至95 ℃保温20 min开始碘试，当碘试呈红棕色即合格。

以玉米浆、硫酸铵、磷酸氢二钾等为营养盐调整培养基中的氮、磷。

1.2  方法

1.2.1  种子罐碳氮比、氮磷比正交摇瓶试验

淀粉制备的糖液、玉米浆、硫酸铵、磷酸氢二钾按照总糖（9%、10%、11%、12%）、碳氮比（20、25、30、35）、氮磷比（2.5、3.0、3.5、4.0）三因素四水平进行正交摇瓶试验，具体见表1。

摇瓶培养基按照表1的正交表配制好以后，每组3个平行摇瓶，250 mL三角瓶装培养基50 g，用三层纱布一层牛皮纸封口包扎121 ℃灭菌25 min，降温至常温后，在无菌环境中接黑曲霉孢子1 500万个/瓶，然后称重W，放入摇床内36 ℃、400 r/min条件下培养26 h取下。对每个摇瓶复重至W，然后做显微镜观察并过滤检测酸度和pH。

试验证明，调整后使种子罐和发酵罐的培养基营养都得到了均衡，而且在一定范围内，只要达到营养的均衡，发酵周期和转化率波动都不大。最高能够做到56.2 h，产酸214.40 g/L水平，见表5。

3  结果与讨论

3.1  碳氮磷比例对菌球形态的影响

对于黑曲霉柠檬酸发酵来说，菌球形态也是影响高产酸的重要因素。菌球松紧适度且小而规则，增大了菌球与介质的接触面积，而且有利于物质传输，因此产酸浓度高、速率快。由于在培养基中，产物柠檬酸需要碳源来转化，因此碳源是过量的，这样，菌体的生长主要靠氮磷来调节。既要控制好菌体生物量，同时也要控制好碳源与生物量之间的比例。合适的碳氮磷比例，有利于菌球的均衡生长。

3.2  总糖对产酸速率和转化率的影响

当培养基中营养达到均衡时，总糖对转化率和周期的影响不显著。是在碳、氮、磷达到某种平衡的条件下，也就是说，培养基中一种营养变动而其他营养也需要随之而调整，使各种营养达到一种平衡。如果在某一种培养基配方中单独调整总糖浓度，则发酵产酸和周期等肯定会随着而发生较大变化。当培养基调整总糖时，氮、磷等营养需要随之调整以保持一定平衡。

4  结 论

本文主要研究了发酵培养基中的碳氮磷平衡问题，从而开发出全清液柠檬酸发酵工艺。为了达到高速产酸和高收率，培养基中的碳氮磷等需要保持动态的平衡。种子罐培养基总糖11%，碳氮比30，氮磷比3.2时，种子的质量大幅度提升。发酵罐培养基在一定的范围内调整总糖时，保持碳氮比70，氮磷比3.5时，可以得到高效发酵水平。

参考文献：

[1] 王博彦，金其荣.发酵有机酸生产与应用手册.北京：中国轻工业出版社，2000-01：124-149.

[2]夏勝洁.不同氮源对柠檬酸发酵的影响[R].石河子长运生化有限责任公司832000.

[3]孙维国.部分有机氮源对柠檬酸发酵的影响[R].宁夏宁馨儿生物工程股份有限公司.

[4]张伟心，王建平，等.有机氮源对柠檬酸发酵的影响[J].河北大学学报：自然科学版，2000（2）.

[5]代真真，周勇，刘玉伟，满云，张继学，王永红，等，柠檬酸发酵过程中液化条件的影响[D].华东理工大学生物工程学院，上海.

[6] 张嗣良，储炬.多尺度微生物过程优化[M].北京：化学工业出版社，2003：230-289