南极磷虾粉培养枯草芽孢杆菌工艺探究

张竞竞 刘爱慧 孙乐彤 孙建安

摘 要 以南极磷虾粉作为培养基成分，研究枯草芽孢杆菌高密度培养的最佳工艺条件，为枯草芽孢杆菌微生态制剂的研制奠定理论基础。以枯草芽孢杆菌数目为指标，使用单因素试验对培养枯草芽孢杆菌的培养工艺进行优化，从而研究出最佳工艺参数。结果表明，以南极磷虾粉为培养基成分培养枯草芽孢杆菌的最佳培养条件为：南极磷虾粉浓度2.5%，接种量10%，装液量100 mL/250 mL，pH值为8.0，发酵时间3 d。在此培养条件下，枯草芽孢杆菌的活菌数可达到3.6×109 CFU·mL-1。

关键词 南极磷虾粉;枯草芽孢杆菌;发酵条件;高密度培养

中图分类号：S963.211 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.23.054

枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，无荚膜，周生鞭毛，能运动，对水产中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物有很强的抑制作用，能有效预防水产动物肠炎、烂鳃等疾病;既可以分解养殖池中的有毒有害物质，还可以分解池中残饵和有机物等，具有很强的清理水中小颗粒垃圾的作用;具有活性较强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，促进饲料中营养素降解和水产类动物对饲料的吸收。

南极磷虾（Antarctic krill）是生活在南大洋中的一种节肢动物门浮游动物，在南大西洋食物链中起到重要作用[1]。南极磷虾是海洋中一种重要资源，它的利用受到了各国的广泛关注[2]。因此，最大化发挥南极磷虾的作用具有非常重要的战略意义。随着人们对南极磷虾的开发与利用的日渐深入，各种磷虾产品已经面世，如磷虾蛋白粉、磷虾油等。南极磷虾粉是南极磷虾油提取过程中产生的副产物，含有丰富的蛋白质和矿质元素等营养成分，是一种优质的培养基资源，利用微生物发酵南极磷虾粉制备微生态制剂也是南极磷虾粉价值体现的一个方向。微生态制剂在改善宿主健康上起到主要作用[3]，正在全球范围内的鱼类和贝类养殖中获得越来越高的科学价值和商业价值 。南极磷虾这一重要资源的开发，可增加资源利用率。

通过单因素试验，以南极磷虾粉为唯一营养成分，探讨发酵时间、南极磷虾粉浓度、接种量、发酵液pH值和发酵液装瓶量5个因素对枯草芽孢杆菌培养效果的影响;以枯草芽孢杆菌的菌数为衡量指标，采用单因素试验设计方案，进行枯草芽孢杆菌发酵条件的优化，为枯草芽孢杆菌微生态制剂的研制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

1.1.1 原料

南极磷虾粉，购自青岛西海岸远洋渔业有限公司;枯草芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），购自CICC（中国工业微生物菌种保藏管理中心）。

1.1.2 主要仪器设备

SPX智能型生化培养箱，购自宁波市科技园区新江南仪器有限公司;BCM-1000型超净工作台，购自苏州净化集团;QYC2112型摇床，购自上海福马实验设备有限公司;LDZX-50KA型立式灭菌锅，购自上海申安医疗器械厂;PL203型电子天平，购自Metteler toledo仪器公司。

1.2 培养条件

1.2.1 种子培养液条件

以自来水配制浓度为3%（w/v）的南极磷虾粉溶液100 mL，调节其pH为8.0，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min后冷却，用于培养枯草芽孢杆菌。培养条件为：30 ℃恒温摇床培养48 h，转速180 r·min-1。培养结束后，培养枯草芽孢杆菌种子培养液菌数应达到1.6×109 CFU·mL-1。

1.2.2 发酵培养液条件

配制不同浓度的南极磷虾粉溶液，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min作为发酵培养基，分别在不同培养时间、不同接种量、不同发酵初始pH和不同装液量条件下进行发酵培养，用于研究枯草芽孢杆菌最适发酵条件。

1.3 探究不同因素对枯草芽孢桿菌菌数的影响

1.3.1 南极磷虾粉浓度对枯草芽孢杆菌菌数的影响

在5个250 mL三角瓶中分别装入100 mL南极磷虾粉发酵培养液，控制南极磷虾粉浓度分别为1%、3%、5%、10%和15%（w/v）。枯草芽孢杆菌的培养时间为

3 d，分别取培养后的枯草芽孢杆菌菌液进行稀释并涂布平板，每个稀释梯度做3次重复操作，并将平板倒置于

30 ℃恒温培养箱中培养24 h之后计数。试验平行重复3次，取其平均值，统计枯草芽孢杆菌的数量，分析南极磷虾粉浓度对枯草芽孢杆菌菌数的影响。

1.3.2 发酵时间对枯草芽孢杆菌菌数的影响

在5个250 mL三角瓶中分别装入100 mL浓度为5%（w/v）的南极磷虾粉发酵培养基，调节其pH为8.0。

121 ℃高压蒸汽灭菌20 min后，将枯草芽孢杆菌种子培养液分别以5%（v/v）的比例接入到5瓶发酵培养液中，分别于30 ℃摇床振荡培养1 d、2 d、3 d、4 d和5 d。其他操作同1.3.1，取其平均值，统计枯草芽孢杆菌的数量，分析发酵时间对枯草芽孢杆菌菌数的影响。

1.3.3 接种量对枯草芽孢杆菌菌数的影响

在5个250 mL三角瓶中分别装入100 mL5%（w/v）的南极磷虾粉发酵培养液，将枯草芽孢杆菌种子培养液分别以0.5%、1%、5%、10%和15%（v/v）的比例接入到5瓶发酵培养液中，其他条件与操作同1.3.1，统计枯草芽孢杆菌的数量，分析接种量对枯草芽孢杆菌菌数的影响。

1.3.4 发酵液pH值对枯草芽孢杆菌菌数的影响

在6个250 mL三角瓶中分别装入100 mL 5%（w/v）南极磷虾粉发酵培养液，调节其pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，其他条件与操作同1.3.1，统计枯草芽孢杆菌的数量，分析发酵液pH值对枯草芽孢杆菌菌数的影响。

1.3.5 发酵液装瓶比例对枯草芽孢杆菌菌数的影响

在5个250 mL三角瓶中分别控制5%（w/v）南极磷虾粉发酵培养液的装瓶比例为12%、20%、40%、60%和80%，调节其pH值为8.0，其他条件与操作同1.3.1，统计枯草芽孢杆菌的数量，分析发酵液瓶装比例对枯草芽孢杆菌菌数的影响。

1.4 枯草芽孢杆菌活菌菌数测定

1.4.1 稀释倒平板法

按10倍稀释法将培养后的菌液制成不同浓度的稀释液，从稀释液中分别吸取100 ?L置于LB固体培养皿中，用无菌涂布棒涂布均匀，每个稀释度做3次重复操作。将涂布后的平板倒置于30 ℃恒温培养箱中培养24 h之后，进行菌落计数。

1.4.2 平板计数

选择适宜的稀释度，菌落数在30～300个的平板进行计数。

1.4.3 计算方法

芽孢杆菌数（CFU·mL-1）=菌落平均数×稀释倍数×10。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾粉浓度对枯草芽孢杆菌菌数的影响

南极磷虾粉浓度对枯草芽孢杆菌菌数的影响如图1所示。当南极磷虾粉浓度在1%～3%范围内时，枯草芽孢杆菌菌数显著增高;当南极磷虾粉浓度为2.5%时，枯草芽孢杆菌菌数达到最高值，为9×109 CFU·mL-1;继续增高南极磷虾粉浓度时，枯草芽孢杆菌菌数则显著减少。经统计学分析可知，南极磷虾粉浓度对枯草芽孢杆菌菌数存在极显著影响。试验以南极磷虾粉为唯一营养成分，进行枯草芽孢杆菌的培养。当南极磷虾粉的浓度过低时，由于可利用的营养成分过少，菌株生长不良，菌数过少;当南极磷虾粉的浓度过高时，培养基中的含水量过少，对微生物的生长及代谢能力产生不利的影响。因此，于本研究条件下，枯草芽孢杆菌生长所需的南极磷虾粉适宜浓度为2.5%。

2.2 发酵时间对枯草芽孢杆菌菌数的影响

发酵时间对枯草芽孢杆菌菌数的影响如图2所示。发酵时间为1～3 d时，枯草芽孢杆菌菌数极速增长，为增长期;当发酵时间到3 d时，枯草芽孢杆菌菌数达到3.5×109 CFU·mL-1;发酵时间4～5 d时，枯草芽孢杆菌生长进入缓慢增长期，菌数增长缓慢;结果表明，枯草芽孢杆菌的适宜发酵时间为3 d。

2.3 接种量对枯草芽孢杆菌菌数的影响

接种量对枯草芽孢杆菌菌数的影响如图3所示。枯草芽孢杆菌菌数在接种量为0.5%～10%的范围内随接种量的增大而极显著增大，最大值为5.5×109 CFU·mL-1;当接种量超过10%时，枯草芽孢杆菌菌数则极显著减少。试验结果表明，枯草芽孢杆菌的适宜接种量为10%。

2.4 发酵液pH值对枯草芽孢杆菌菌数的影响

发酵液pH值对枯草芽孢杆菌菌数的影响如图4所示。当发酵液的pH值在5.0～8.0范围内时，随着pH值的升高，菌数极显著增多;pH值为8.0时，枯草芽孢杆菌菌数达最高值为3.4×109 CFU·mL-1;当pH值高于8.0后，枯草芽孢杆菌菌数极显著减少。这一结果表明，发酵液偏酸或偏碱都不利于枯草芽孢杆菌的生长，枯草芽孢杆菌生长的适宜pH值为8.0。

2.5 发酵液装瓶比例对枯草芽孢杆菌菌数的影响

发酵液装瓶比例是通过影響溶氧量对枯草芽孢杆菌的生长产生影响的，发酵液中的溶氧量大小直接影响着菌株的呼吸代谢。发酵液装瓶比例对枯草芽孢杆菌菌数的影响如图5所示。当发酵液装瓶比例为40%时，枯草芽孢杆菌菌数达到最高值为3.6×109 CFU·mL-1。发酵液装瓶量少，发酵液中的营养物质数量少，不利于菌体生长;反之，装瓶量大，可能影响容器中的氧含量。由于枯草芽孢杆菌是好氧菌，故容器中的氧含量减少不利于菌体生长。试验结果显示，枯草芽孢杆菌生长的适宜发酵液装瓶比例为40%。

3 结论

以南极磷虾粉为原料进行研究，基本实现了对培养枯草芽孢杆菌工艺的优化，可以提高南极磷虾的利用价值。通过多个单因素试验，并将数据进行对比，从而得出单一变量中培养枯草芽孢杆菌的最适宜条件为：南极磷虾粉浓度2.5%，接种量10%，pH值8.0，发酵时间3 d，发酵液装瓶比例40%。

参考文献：

[1] 黄洪亮，陈雪忠，冯春雷.南极磷虾资源开发现状分析[J].渔业现代化，2007，34（1）：48-51.

[2] Delgado GTC， Tamashiro WMDSC， Junior MRM， et al. The putative effects of prebiotics as immunomodulatory agents[J].Food Research International，2011，44（10）：3167-3173.

[3] 胡珊，胡事君，吴清平，等.益生菌制剂加工技术的研究概况[J].中国乳品工业，2010，38（3）：47-50.

（责任编辑：刘昀）