香烟烟雾与慢性应激联合暴露对大鼠学习记忆能力的影响

王 倩，黄云飞，雷 磊，苏德奇*

(新疆医科大学公共卫生学院毒理教研室，新疆乌鲁木齐 830001)

大量流行病学研究证明，高度或长期的精神紧张会导致高血压、肥胖、焦虑、抑郁等诸多疾病[1]。中国是世界上最大的烟草消费国，吸烟者总数达到3.01亿，每年因烟草死亡的人数超过100万，约占全国死亡人数的12%[2-3]。烟草滥用问题早已受到关注，有研究显示，紧张会诱发个体对香烟的渴求，经常处于紧张状态的人群吸烟率较高，增加烟草使用的危险性，从而影响人体健康[4]。近年来对吸烟及紧张状态的研究大多集中在对暴露于单一因素的研究[5-6]，二者联合作用对学习和记忆能力影响的研究较少，即吸烟与紧张状态联合对机体的危害是否存在交互作用，其作用形式值得深入探讨。胆碱能神经递质参与学习和记忆等相关的重要生理活动[7]。因此本研究采用2×2析因设计，对大鼠进行香烟烟雾、慢性应激单独及联合暴露，通过Morris水迷宫实验，观察大鼠学习和记忆行为，测定大鼠血清中皮质醇(cortisol，Cort)、乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)、胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferase，ChAT)浓度和乙酰胆碱脂酶(acetylcholinesterase，AchE)活力以评价香烟烟雾和慢性应激联合对大鼠学习记忆能力的作用形式，探讨香烟烟雾和慢性应激联合作用对大鼠学习和记忆能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

Cort Elisa试剂盒，生产批号201904，购于上海雨朵生物科技有限公司；ACH、CHAT Elisa试剂盒，生产批号201905，购于上海酶联生物科技有限公司；ACHE试剂盒，生产批号20190516，购于南京建成生物化学试剂有限公司。

恒温水浴锅HH-501型，购于常州万合仪器制造有限公司；UV-2501PC型紫外-可见分光光度计，购于日本Shimadzu公司；Benchmark PLUS型全波长酶标仪，购于BIO-RAD公司；DNP-9082型电热恒温培养箱，购于上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验动物及受试物

SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量80～120 g，供应于新疆医科大学实验动物中心，实验动物使用许可证号SYXK(新)2016-0002。受试物为某品牌过滤嘴香烟，焦油含量18 mg，烟气烟碱含量1.1 mg。

1.3 动物分组及动物模型制作

大鼠适应性喂养1周后(室温控制在22～25℃，相对湿度保持在55%～65%，普通喂养)，按照2×2析因设计随机分为对照组、香烟烟雾组、慢性应激组、联合干预组，每组10只，雌雄各半，见表1。

表1 动物分组

对照组大鼠不做任何处理。香烟烟雾组进行呼吸道静式染毒，把大鼠放进40 L的染毒箱内，燃烧香烟，让香烟充分进入染毒箱内，每天1次，每次10支，每次1 h；慢性应激组通过慢性应激模拟人的紧张，根据文献[8-9]进行调整，包括双下肢束缚倒吊、噪音、夹尾、热蒸汽熏浴、冷水浴5种慢性应激方式，每天随机给予1种应激方式，每种慢性应激方式不连续应用，预防实验大鼠产生适应性；联合干预组同时暴露于香烟烟雾和慢性应激中，大鼠每日先按照慢性应激组处理，后按香烟烟雾组方法进行，4组暴露时间均为12周，每隔两周称重并记录。

利用血清皮质醇浓度来确定慢性应激模型的成功建立[10]。

1.4 实验动物处理及脑的脏器系数测定

12周染毒结束后，断食24 h，各组大鼠称重并记录，麻醉后处死，腹主动脉采血，血样于4℃、1 500 r/min离心15 min，取上清，于-80°冰箱保存；迅速取出脑组织，称取脑质量并计算脑的脏器系数(脏器系数=脏器质量/体质重×100%)。

1.5 病理学观察

切下大鼠右脑组织并置于4%多聚甲醛中进行固定24～48 h，进行常规石蜡包埋、切片、HE染色及封片，显微镜观察脑组织神经元、胶质细胞、细胞核变化并拍照。

1.6 Morris水迷宫实验

分别于染毒2、4、8、10、12周时，采用水迷宫实验对4组大鼠学习记忆能力进行检测。水中放入奶粉使其变为乳白色，将大鼠任意从四个象限之一面向池壁放入水中，记录大鼠逃避潜伏期，即大鼠爬上站台并保持10 s所需时间，若大鼠120 s未找到站台，则记录为120 s，每次实验进行1 d。

1.7 血清中指标测定

采用相应试剂盒测定大鼠血清中ACHE活力，采用相应Elisa试剂盒检测大鼠血清中Cort、ACH、CHAT含量，各实验步骤均严格按照说明书进行。

1.8 统计学分析

实验数据用SPSS 24.0软件分析，计量资料用xˉ±s描述；组间比较用单因素方差分析；交互作用评价用析因设计方差分析；以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠应激模型的确认

与对照组比较，慢性应激组大鼠Cort浓度显著增加(P＜0.05)，表明慢性应激组大鼠处于紧张状态，提示模型建立成功，见表2。

表2 各组大鼠Cort检测结果(n=10，x±s)

2.2 大鼠体质量检测结果

与对照组比较，香烟烟雾、慢性应激及联合干预组大鼠体质量差异均无统计学意义(P＞0.05)，联合暴露对大鼠体质量的影响不存在交互作用(P＞0.05)，见表3和表4。

表3 各组大鼠体质量检测结果(n=10，x±s，g)

表4 大鼠体质量析因设计资料的方差分析结果

表5 各组大鼠脑质量及脑脏器系数结果(n=10，x±s)

2.3 大鼠脑质量及脏器系数结果

与对照组比较，香烟烟雾、慢性应激及联合干预组大鼠脑质量及脑脏器系数差异均无统计学意义(P＞0.05)，联合对大鼠脑质量及脑的脏器系数的影响均不存在交互作用(P＞0.05)，见表5和表6。

2.4 大鼠脑组织病理观察结果

各组大鼠脑组织经HE染色后的病理形态见图1，对照组大鼠脑组织神经元形态规则，核膜边缘清晰，核仁明显，结构清晰完整。香烟烟雾组大鼠神经元可见轻度核固缩，脑膜血管中度充血及轻度出血，胶质细胞增生。慢性应激组大鼠神经元可见轻度核固缩及轻度淤血。联合干预组大鼠神经元可见中度核固缩，脑膜轻度淤血及水肿，神经元周围可见空泡形成。

表6 大鼠脑质量及脑脏器系数析因设计资料的方差分析结果

图1 各组大鼠脑组织病理学观察结果(HE染色，10×20)

2.5 大鼠Morris水迷宫实验结果

与对照组比较，第4、8周慢性应激组逃避潜伏期明显增加(P＜0.05)，第10周二者单独及联合干预组逃避潜伏期均明显增加(P＜0.05)，且联合干预组逃避潜伏期最长；与慢性应激组比较，第2周联合干预组逃避潜伏期显著减少(P＜0.05)，香烟烟雾与慢性应激联合暴露存在交互作用(P＜0.05)，交互作用呈拮抗作用(P＜0.05)，见表7和表8。

表7 各组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期结果(n=10，x±s)

表8 大鼠逃避潜伏期析因设计资料的方差分析结果

2.6 大鼠血清ACH、CHAT含量及ACHE活力

与对照组比较，香烟烟雾、慢性应激单独及联合干预组大鼠ACH含量明显降低(P＜0.05)，慢性应激组ACHE活力升高、CHAT含量降低(P＜0.05)；香烟烟雾与慢性应激联合暴露对ACH、CHAT含量及ACHE活力均无交互作用(P＞0.05)，见表9和表10。

3 讨论

研究发现，慢性应激可导致下丘脑－垂体－肾上腺皮质(HPA)轴激活，从而引起糖皮质激素(GC)分泌升高，造成机体损伤和疾病[10]。近年来，在与慢性应激相关的动物实验中常将皮质醇浓度升高作为慢性应激模型建立成功的标志[11]。本次研究结果显示，慢性应激组Cort浓度升高，提示慢性应激模型建立成功。本次研究表明，联合干预组的大鼠体质量、脑重量及脑脏器系数与对照组差异均无统计学意义，而且经统计学分析未发现存在交互作用，提示在本次实验条件和观察期内，香烟烟雾和慢性应激对大鼠生长发育无明显影响。

表9 各组大鼠ACH、ACHE、CHAT结果(n=10，x±s)

表10 大鼠ACH、ACHE、CHAT析因设计资料的方差分析结果

Morris水迷宫是研究学习记忆能力最常用的工具之一，是目前检测动物学习记忆能力的最佳工具[12]。本次研究的水迷宫结果发现，第2周时，香烟烟雾与慢性应激联合干预组的逃避潜伏期明显减少，呈拮抗作用，提示在本实验条件下，短期内(2周左右)二者联合进入机体下可能相互抑制。第10周，香烟烟雾、慢性应激单独及联合干预组大鼠逃避潜伏期明显高于对照组，表明长期(10周左右)的香烟烟雾与慢性应激单独及联合暴露均会导致大鼠学习和记忆能力下降，与葛晓东[13]、吴红芳[14]等的研究一致；此外，第10周开始联合干预组的逃避潜伏期最长，HE染色结果也表示联合干预组对脑组织造成的影响最大，提示长时间(10周左右)的联合暴露后大鼠的学习记忆能力损伤最严重。

ACH作为脑内重要的神经递质，与中枢胆碱能系统密切相关，在学习记忆过程中起着重要作用，当其水平发生变化时，学习记忆能力也会随之改变。ACH是一种由ACHE水解而成的酶，CHAT是参与ACH合成的关键胆碱能标记物，二者共同维持ACH的动态平衡,与ACH的合成有密切关系[15-16]。袁圣楠[17]发现在大鼠学习记忆受损的过程中，脑内神经递质乙酰胆碱含量降低。本次研究发现，香烟烟雾、慢性应激单独及联合干预组大鼠ACH含量显著降低，这与以往学习记忆相关研究结果一致[18]。慢性应激组ACHE活力升高、CHAT含量降低，而香烟烟雾组CHAT含量及ACHE活力变化并不明显，提示大鼠学习和记忆能力下降主要是通过造成ACH含量降低来实现的。析因分析结果显示，香烟烟雾和慢性应激联合干预对大鼠血清中ACH、CHAT含量及ACHE活力的影响均不存在交互作用，因此尚不能认为香烟烟雾和慢性应激联合暴露比单独暴露更容易对大鼠血清中ACH、CHAT含量及ACHE活力产生影响。

综上所述，香烟烟雾和慢性应激联合暴露在第2周时，对大鼠学习和记忆能力产生拮抗作用；第10周之后二者单独及联合暴露均会引起大鼠学习记忆能力下降，联合暴露组损伤最严重；二者单独及联合暴露主要通过造成ACH合成受损，导致大鼠学习和记忆能力下降，联合暴露对ACH、CHAT含量及ACHE活力的影响未产生交互作用；香烟烟雾和慢性应激联合暴露的作用形式并非不变，而会因暴露时间、检测指标的不同而改变，具体作用机制需进一步深入研究。