本草香对主流烟气暴露大鼠心血管系统蛋白组学的影响研究

刘梦雅，苏加坤，王若琪，徐 达，秦秀军，李建国，安 全，蔡继宝，*

(1.中国辐射防护研究院，药物毒理与放射损伤药物山西省重点实验室，中核放射毒理与放射性药物临床前评价重点实验室，山西 太原030006；2.江西中烟工业有限责任公司，江西 南昌 330096)

据2019年发布的《中国心血管病报告2018》显示，我国心血管病现患人数为2.9亿，心血管病死亡率居首位[1]。流行病学数据分析以及许多试验研究结果表明，吸烟除直接危害到人体的呼吸系统外，对人体的心脑血管、消化道等组织器官均产生不同程度的损害[2]。而多项研究表明烟草中含有引起冠状动脉硬化、高血压、冠心病等心血管疾病的发病率升高的成分[3-5]。本草香是香药本草制备的各种香料，其在疾病预防与治疗方面的功用也受到人们的关注[6]，本研究采用添加本草香成分香烟与普通香烟干预大鼠后，利用串联质谱标记(tandem mass tags，TMT)定量蛋白质组学研究技术探索本草香对大鼠心血管系统相关蛋白的改变情况，旨在寻找差异蛋白以及相关生物学通路，为进一步研究本草香的生物学功效提供研究线索。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠24只，体质量200～220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK-(京)2016-0006，质量合格证号11400700300671。饲养管理于中国辐射防护研究院动物实验中心，实验动物使用许可证号SYXK(晋)2013-0002。

1.2 试剂和主要仪器

普通卷烟和添加本草香成分的金圣4号卷烟，均产自江西中烟工业有限责任公司，每支卷烟含烟碱1.0 mg，焦油10.0 mg，一氧化碳10.0 mg；HRH-WBE 3986型动物全身烟气暴露系统，购于北京慧荣和科技有限公司；TMT标记试剂盒，购于Thermo Fisher公司。

1.3 动物分组及处理

根据动物体质量按分段均衡随机分组法(DAS1.0软件)将动物进行分组，分为普通香烟烟气暴露组和金圣4号香烟烟气暴露组，每组12只。两组分别放置于染毒腔体内进行主流烟气暴露染毒60 min，烟气浓度控制在(1 100±110)mg/m3。每天染毒1次，3个月后麻醉取心脏，送样本检测。

1.4 蛋白提取及TNT定量蛋白质组学实验操作步骤

将冷冻的样品心脏组织取出适量，转移至1.5 mL离心管中。加入300 μL样品裂解液，加入蛋白酶抑制剂PMSF使其终浓度为1 mmol/L。冰上超声破碎3 min。将溶液在室温下12 000 r/min离心10 min，取上清，并再次离心取上清。上清即为样品的总蛋白溶液，进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80℃备用。蛋白采用BCA法测定蛋白浓度。每个样品取10 μg蛋白，采用12%SDS-PAGE进行分离；分离后的凝胶采用考马斯亮兰染色法进行染色。胰蛋白酶酶解及标记：蛋白定量后每个样品各取100 μg于10 K的超滤管中，取120 μL还原剂缓冲液(10 mmol/L DTT，8 mol/L尿素，100 mmol/L TEAB，pH=8.0)，60℃反应1 h；加入IAA至终浓度为50 mmol/L，室温避光反应40 min；4℃、12 000 r/min离心20 min，弃掉收集管底部溶液；加入300 mmol/L的TEAB缓冲液100 μL，12 000 r/min离心20 min，2次；更换新收集管，在超滤管中加入300 mmol/L的TEAB缓冲液100 μL，并加入1 μg/μL的测序级胰蛋白酶溶液2 μL，37℃反应12 h；12 000 r/min离心20 min，收集酶解后肽段，在超滤管中再加入200 mmol/L的TEAB缓冲液50 μL，12 000 r/min离心20 min，收集管底溶液并冻干。向冻干样品中加入200 mmol/L的TEAB缓冲液100 μL，涡流混匀，取出40 μL样品于1.5 mL EP管中进行标记反应；从冰箱中取出TMT试剂，平衡到室温，加入41 μL无水乙腈，涡流5 min，离心；取41 μL TMT试剂加到样品中，涡流混匀，室温放置1 h；加入8 μL 5%羟胺终止反应15 min，冻干后于-80℃保存。反相色谱分离：梯度洗脱收集8～60 min的样品，依次每隔1 min收集洗脱液到1～15号离心管中，按此顺序循环收样至梯度结束。收集好后真空冷冻干燥抽干，样品冷冻保存进行质谱检测。

1.5 数据处理与分析

采用Proteome DiscovererTM2.2(美国Thermo公司)软件分析差异蛋白，所用数据库为来自于UniProt的大鼠数据库。肽段鉴定的假阳性率控制在1%以下，利用倍数变化值进行差异蛋白筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥1.2且P≤0.05。采用基因本体(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Gene and Genomic Encyclopedia，KEGG)数据库对差异蛋白进行富集分析，以判定差异蛋白主要影响的生物学功能或者通路。对差异蛋白进行非监督层次聚类，利用热图的形式展示差异基因在不同样本间的表达模式。

2 结果

2.1 普通香烟组与金圣4号香烟组大鼠心脏组织差异表达蛋白

用TMT法检测吸烟3个月后普通香烟组与金圣4号香烟组大鼠心脏组织蛋白的表达情况，在两组组织中，表达水平差异在1.2倍以上的蛋白43个，其中在金圣4号香烟组心脏组织中下调表达41个，上调表达2个。图1将比较产生的差异表达情况反映到火山图中，图2为聚类分析结果，即对差异表达蛋白进行的非监督层次聚类，如同一样品能通过聚类出现在同一簇中，则聚在同一簇中的蛋白可能具有相似的生物学功能。

图1 普通香烟组与金圣4号香烟组大鼠心脏组织差异表达蛋白火山图

图2 普通香烟组与金圣4号香烟组大鼠心脏组织差异蛋白热图

2.2 普通香烟组与金圣4号香烟组大鼠心脏组织差异蛋白的GO富集分析

根据GO分析对基因的注释，对普通香烟组与金圣4号香烟组大鼠43个差异表达蛋白进行分子功能、细胞组分及生物学过程的分类，分析结果显示分子功能富集主要涉及结构分子活动、NADPH绑定和细胞黏附分子结合等；细胞组分富集主要涉及细胞外空间、细胞外区域部分和细胞外区域等；生物过程富集主要涉及细胞激活、调节体液水平和血小板活化等。详见图3～5。

图3 分子功能富集分析结果

图4 细胞组分富集分析结果

图5 生物过程富集分析结果

2.3 差异蛋白的KEGG富集分析

对普通卷烟和金圣4号香烟烟气暴露3个月组大鼠心脏组织差异蛋白进行KEGG富集分析，得到蛋白质在细胞中的代谢途径以及这些蛋白质的功能差异，差异蛋白涉及血小板活化、补体和凝血级联、氮代谢、半乳糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、果糖和甘露糖代谢等6个生物学通路。见表4和图6。

表4 烟气染毒干预3个月后两组大鼠心脏组织差异蛋白的生物学通路

图6 烟气染毒3个月后两组大鼠心脏组织差异蛋白的生物学通路

2.4 蛋白相互作用分析

基于OmicsBean组学数据整合分析云平台，进行了差异蛋白及KEGG通路之间的蛋白互作分析，分析得到蛋白互作汇总结果。KEGG富集结果中显著性前十的通路以及与之互作的蛋白之间的互作网络图，结果见图7。

3 讨论

在我国，心脑血管疾病的发病率和死亡率居高不下，占居民疾病死亡构成的40%以上。研究表明，吸烟可引起心血管系统的损伤，增加心血管发病的风险[1]。研究显示，损伤作用机制可能与吸烟对血液中的血小板黏性的改变有关，血小板黏性增加可导致冠脉血栓的形成，从而增加心肌梗死的发病率，此外，血小板在冠心病中冠状动脉粥样硬化斑块破裂及血栓形成导致猝死中起重要作用[7]。

图7 蛋白相互作用网络图

本草香是中国医药史中一类具有多种功效的香药，见载于《本草纲目》等重要本草典籍，研究表明，本草香药除能产生良好的香味刺激外，还能促进机体免疫球蛋白含量提高，进而增强人体防御疾病的能力[6]，本文旨在研究本草香的生物学功效。通过采用GO和KEGG数据库对吸烟组43个差异蛋白进行生物信息学分析，结果显示，在吸烟后3个月蛋白表达的改变涉及到多种分子功能、细胞组分及生物学过程的变化，主要包括结构分子活动、血小板活化、血液凝固、细胞外空间等。

我们筛选出与脂蛋白的转化与代谢过程有关的载脂蛋白E(ApoE)，ApoE是一种多态性蛋白，其浓度与血浆甘油三酯含量呈正相关。研究表明，ApoE基因多态性与血脂异常以及冠状动脉粥样硬化的关系密切，其中ApoE4型是冠心病发生的重要影响因子[8]。差异表达基因的KEGG富集分析的结果显示，差异表达蛋白涉及6个生物学通路，主要有血小板活化、补体和凝血级联及代谢功能等。血小板活化是动脉粥样硬化血栓的标志特征之一，血小板活化后会发生血小板聚集率增加，氧自由基，血栓素以及血小板活化因子合成明显增加，同时在冠心病的发病中也起着重要作用[9]。凝血与补体级联反应信号通路中有多种与疾病相关的炎症或免疫类差异蛋白，这些蛋白各自执行生理功能，且又相互联系[10]，该信号通路上的差异蛋白点可以作为本草香发挥作用的关键靶点。除此之外，差异表达蛋白还涉及氮代谢以及糖代谢途径。

本研究主要观察了两种香烟干预3个月后大鼠心脏组织蛋白表达的变化，筛选出差异蛋白，这些蛋白多数与血小板活化、补体和凝血级联和代谢等生物学途径相关。表明本草香干预对心血管系统的影响涉及多个蛋白及生物学过程，是一个复杂且相互影响的过程，此次筛选出的相关结果将为进一步研究普通香烟组大鼠与金圣4号香烟组造成的差异表蛋白以及作用机制提供研究线索，为研究本草香的生物学功效提供研究帮助。