血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平检测在诊断子宫腺肌病中的应用

陈新元,黄 胜，王同利

(浙江省温州市中心医院检验科 325000)

子宫腺肌病是由子宫内膜腺体、间质等侵入子宫肌层导致的，是30～50岁经产妇的常见疾病类型，虽然子宫腺肌病不会导致患者死亡，但患病过程中会有不同程度的痛经，严重影响患者生理及心理健康[1]。临床上子宫腺肌病的诊断主要依赖于超声、CT等影像学检测手段，但上述方法均存在一定的局限性，且子宫腺肌病常被误诊为子宫肌瘤，仍需要手术后病理检测确诊。因此，寻求早期、灵敏、高效的血清标记物应用于临床检测，对于子宫腺肌患者有十分重大的意义[2]。近几年，随着血清miRNA的研究发展，发现血清miRNA可用于分子诊断[3]，本研究旨在评估血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平检测在子宫腺肌病中的诊断效能，并分析血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平与痛经程度的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将2017年2月至2018年2月本院收治的子宫腺肌病患者216例纳入观察组，同时招募同时间于本院体检的60名健康者作对照组。观察组年龄35～49岁，平均(43.62±9.41)岁；体质量指数(21.56±2.37)kg/m2；孕次(1.69±0.52)次；月经周期(30.54±3.62)d。对照组年龄34～50岁，平均(42.74±10.21)岁，体质量指数(22.17±2.69)kg/m2；孕次(2.15±0.68)次；月经周期(29.75±4.16)d。两组受试者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院伦理委员会审核批准。

1.2 纳入标准与排除标准 纳入标准：子宫肌腺患者术后经病理检测确诊；年龄大于或等于30岁；依从性好；签署知情同意书；对照组受试者身体健康，实验室检查各项指标均正常。排除标准：心、肝、肾等器质性病变；严重感染；合并糖尿病、甲状腺功能亢进等内分泌疾病；先天性免疫疾病；血液系统疾病；就诊前接受抗感染治疗、激素治疗；精神障碍。

1.3 试剂与仪器 Trizol试剂购买于日本Takara公司，逆转率试剂盒、荧光染料SYBR Green Mix、荧光定量PCR试剂盒购买于美国Sigma公司，PCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司提供，荧光定量PCR仪购买于美国BioRad公司。

1.4 qRT-PCR检测血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平 于清晨空腹抽血5 mL，收集上层血清，采用Trizol试剂盒提取血清中总RNA,经逆转率为cDNA模板，采用实时荧光定量PCR仪扩增血清中hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p。程序设置条件为：95 ℃预变性90 s，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。采用2-△△CT法进行半定量分析，以GADPH为内参，计算hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p的表达，其引物序列[4-5]见表1。上述检验均由金域医学检验中心检测完成。

表1 引物序列表

1.5 方法 比较两组受试者血清中hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p的表达，分析hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p表达与子宫腺肌患者临床病理参数的关系，并观察hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p诊断子宫腺肌病的诊断效能。

1.6 痛经评分 参照子宫肌瘤症状及健康相关生活质量问卷(UFS-QOL)[6]，对子宫腺肌患者痛经现象进行疼痛程度评分，分值1～5分，完全不痛计为1分，偶尔痛计为2分，比较痛、偶尔口服药物计为3分，非常痛、经常口服药物计为4分，极度痛计为5分。

2 结 果

2.1 两组血清中hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p表达的比较 与对照组比较，子宫肌腺患者血清中hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p的表达均显著增高(P<0.05)，见表2。

表2 两组血清中hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p表达的比较

2.2 血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平诊断子宫腺肌的临床价值 ROC曲线如图1所示，血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平可有效区分子宫腺肌患者和健康者，当血清hsa-miR-22-3p/U6≥1.17时，诊断子宫腺肌的灵敏度为93.3%，特异度为64.8%(P<0.05)；当血清hsa-miR-103a-3p/U6≥2.46时，诊断子宫腺肌的灵敏度为93.3%，特异度为77.8%(P<0.05)。见表3。

图1 血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平对子宫腺肌诊断的ROC曲线分析

指标AUC灵敏度特异度95%CIhsa-miR-22-3p0.86693.3%64.8%0.820～0.911hsa-miR-103a-3p0.92093.3%77.8%0.886～0.954

2.3 血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平与痛经程度的相关性分析 Pearson相关分析显示，血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平分别与子宫腺肌患者痛经程度呈正相关，相关系数为r=0.57、0.64，P=0.032、0.014。

3 讨 论

子宫腺肌病病理变化表现为子宫内膜腺体、间质的移位，且伴随着周围细胞的增殖[7]。子宫腺肌病多发于产后、人工流产后，具体发病机制尚不明确；临床表现继发性痛经，月经过多，慢性盆腔痛等，多采用保守性治疗，但其复发率极高，手术切除子宫仍是最有效的根治手段，但对于仍有生育需求的女性来说是不能接受的[8]。但子宫腺肌病早期并无明显的病症，确诊时病情已经开始进展，因此早期诊断子宫腺肌意义重大[9]。目前主要应用影像学检测诊断子宫腺肌病，但仍有一定的漏诊、误诊概率[10]。因此，开发检测灵敏度、特异度高的子宫腺肌标志物，辅助其他诊断方法提高子宫腺肌病的确诊率成为研究热点。

mi RNAs是一类内源基因编码的小分子非编码单链RNA分子，大多数以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中，参与调节体内多种基因[11]。mi RNAs广泛存在于人体血清及组织中，其序列具有高度的保守性，据报道，mi RNAs介导多种分子途径参与肿瘤的发生、发展过程，且不同的肿瘤类型其表达谱不同[12-13]，故mi RNAs的不同表达可能对疾病的病理表征有一定的区分作用，此外，血清mi RNAs适用于常规检测，有成为血清标志物的潜能。研究发现，mi RNA可能参与子宫内膜异位症的发生、发展，子宫内膜异位症是指子宫内膜组织种植与子宫内膜以外的位置[14]。尽管子宫腺肌病和子宫内膜异位症是两种不同的妇科疾病，但二者在主要症状和病理机制等方面有相似之处，但mi RNAs 与子宫腺肌病的相关研究鲜少报道，故本研究拟探究血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平检测在诊断子宫腺肌病中的应用。

研究表明，血清中检测到的mi RNA有两种来源：一种是直接由细胞分泌的，另一种是机体选择性包裹mi RNA在外泌体、微小体等膜性结构中，运输至胞外后进入血液循环，提示细胞生长的不同阶段会分泌不同的mi RNA，可能产生不同的功能和作用[15]。血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平应用于子宫腺肌病诊断研究较少，但在其他疾病中研究较多。孙月玲等[16]研究显示外周血miR-22-3p在重症急性胰腺炎患者中呈高表达，其诊断重症急性胰腺炎的AUC为0.729，灵敏度为57.41%，特异度为83.70%，且与重症急性胰腺炎的CT分级、胸水情况等病理参数有关。张亚珍等[17]研究显示miR-103a-3p在乳腺癌组织和血清中呈低表达，可能通过调控PDK4下调机体糖酵解过程，从而抑制乳腺癌细胞的增殖。

本研究通过实时荧光定量PCR检测子宫腺肌患者与健康者血清中hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平，发现子宫腺肌患者血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平显著高于健康者，表明hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p可能参与调控子宫腺肌病的发生、发展。ROC曲线显示，hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p对子宫腺肌病诊断的AUC分别为0.866、0.920，表明通过检测血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平可以有效区分子宫腺肌患者和健康者，能较准确的诊断，且hsa-miR-103a-3p的诊断价值更高，与徐爱云等[18]报道一致。80%的子宫腺肌患者均存在痛经的症状，本研究通过Pearson相关分析显示，血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平分别与子宫腺肌患者痛经程度呈正相关，表明血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p水平还可一定程度上预测子宫腺肌病的严重程度。然而hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p参与子宫腺肌病的发生、发展的具体分子机制还有待研究。

综上所述，血清hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p在子宫腺肌患者血清中高表达，且对子宫腺肌病有较高的诊断价值，且与子宫腺肌患者痛经程度呈正相关，可作为子宫腺肌病潜在的血清标志物，应用于子宫腺肌病的早期诊断。后期还需要扩大样本量作进一步验证，此外，还可继续探讨hsa-miR-22-3p、hsa-miR-103a-3p参与子宫腺肌病的发生、发展过程的分子途径，使得研究结果更加完善。