正交实验法优化黄芩中总黄酮的提取工艺

2019-12-03

中国民族民间医药 2019年21期

江苏食品药品职业技术学院药学院，江苏淮安 223001

黄芩是唇形科植物黄芩的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，主要用于治疗湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽、高热烦渴、疮毒、胎动不安等症[1]。黄芩中含有的成分为黄酮类、萜类、挥发油等化合物[2-4]，其中主要活性成分为黄酮类化合物。研究显示黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、神经及肝脏保护等作用[5]。基于此，本实验采用正交实验法，以总黄酮得率为考察指标，对黄芩总黄酮的提取工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂黄芩(淮安广济大药房)；芦丁 98%(南京广润生物制品有限公司)；亚硝酸钠(莱阳市康德化工有限公司)；结晶三氯化铝(天津基准化学试剂有限公司)；氢氧化钠(上海实意化学试剂有限公司)；无水乙醇(莱阳市康德化工有限公司)。

1.2 仪器子华牌循环水真空泵(巩义市子华仪器有限责任公司)；T6型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；ME203E型分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；恒温水浴锅(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)；SY5200-D型超声波清洗机(上海声源超声波仪器设备有限公司)。

2 实验方法

2.1 对照品溶液配制及标准曲线的绘制精密称定芦丁对照品，用体积分数70%乙醇溶解并定容，得到0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。精密吸取0.2 mg/mL浓度的芦丁标准溶液0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40 mL，分别置于5mL EP管中，各加体积分数70%的乙醇至2.4 mL，加5%的亚硝酸钠0.24 mL，摇匀静置6 min，加10%的硝酸铝溶液0.24 mL，混匀后放置5 min，加1 mol/L的氢氧化钠0.8 mL，再加70%的乙醇0.32 mL，于510 nm波长处测量吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标，以芦丁浓度(X)为横坐标，绘制其标准曲线。

2.2 供试品溶液的配制及总黄酮得率的测定黄芩药材粉碎，精密称取不同重量的黄芩，再按不同的料液比加入一定量的乙醇，在不同的提取时间和提取次数的条件下分别进行加热回流提取，离心，过滤。所得滤液置于250mL容量瓶中，冷却，用相应体积分数的乙醇定容，摇匀，即得样品溶液。按“2.1”项方法操作，加5%的亚硝酸钠0.24 mL，摇匀静置6 min，加10%的硝酸铝溶液0.24 mL，混匀放置5 min，加1mol/L的氢氧化钠0.8 mL，再加70%的乙醇0.32 mL，于510 nm波长处测量吸光度。根据标准曲线，可以求出黄芩提取液中总黄酮的得率。

2.3 正交实验因素水平表由于黄芩中的主要有效成分是黄酮类化合物，难溶于水而易溶于有机溶剂。根据工艺要求，选择料液比、乙醇浓度、提取次数、提取时间4个主要因素，以总黄酮得率作为指标进行正交试验，因素水平表，见表1。

表1 正交实验法因素水平表

2.4 验证性实验称取同一批黄芩粉末3份，按上述正交实验最佳优化工艺条件进行加热回流提取，按“2.2”项方法操作测定黄芩总黄酮的得率。

3 结果

3.1 芦丁的标准曲线回归处理后得标准曲线方程：Y=0.005X+0.0884，其中相关系数R2=0.9981，表明芦丁浓度在0～200 μg/mL范围内与吸光度值呈现良好的线性关系。如图1所示。

图1 芦丁标准曲线图

3.2 正交实验正交实验设计结果和极差分析结果分别见表2和表3。由表3可得，D的极差R最大，其次是B、A、C。极差越大，该因素对得率的影响程度越高。因此，在采用乙醇回流提取法时，以总黄酮的得率为指标，4个因素对总黄酮得率的主次影响顺序为：D>B>A>C，即提取次数>料液比>乙醇浓度>提取时间。从各因素水平看(K值分析)，A因素为K2>K3>K1，B因素为K1>K2>K3，C因素为K3>K2>K1，D因素为K3>K2>K1。由上述分析可以确定最佳提取工艺条件为A2B1C3D3，即乙醇浓度70%，料液比为1∶9，提取时间为3 h，提取次数为4次。

表2 正交实验设计及结果

表3 极差结果分析

注：表中Ki值为在各水平因素下总黄酮含量的平均值，R为极差，即平均值的最大值和最小值的差值。

3.3 验证性实验按照得出的最佳提取条件A2B1C3D3，即以70%乙醇，料液比1∶9，回流提取4次，每次3 h进行提取，3次总黄酮得率分别为6.51%、7.19%、6.76%，表明该方法稳定可行，适合黄芩总黄酮的提取。

4 讨论

黄芩中黄酮类物质属于中等极性物质，易溶于有机溶剂，而难溶于水。本实验选用含水乙醇作为提取溶剂，以总黄酮得率为评价指标，采用正交实验法优化黄芩中总黄酮的提取工艺条件，得到70%乙醇，料液比1∶9，回流提取4次，提取时间每次3 h为最佳提取条件。通过验证实验，证明黄芩在最佳提取条件下总黄酮得率高，提取工艺条件稳定可靠。通过分析极差，提取次数对总黄酮含量影响最大，其次分别是料液比、乙醇浓度和提取时间。因此，在实际操作中，要综合考虑工业生产和节约成本。在进行黄芩中总黄酮的提取时，要注意各工艺参数的调控。