葛芪平渴丸的质量标准研究

辛玲歌 赵 锐

陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000

“葛芪平渴丸”是我院脾胃肾病科名老中医以辨证论治为基础，根据中医药理论，结合临床实践，总结多年的经验组方，由葛根、黄连、薏苡仁、熟地黄等14味中药材组成，具有益气健脾、清热生津、活血化瘀的功效，临床上多用于Ⅱ型糖尿病合并肥胖、血脂异常、胰岛素抵抗属气阴两虚，热毒夹瘀者，可有效控制Ⅱ型糖尿病及其并发症。通过长期的临床应用和对患者的随访，该方疗效显著，不良反应及毒副作用小，使用安全，且价格低廉，深受广大患者的好评。方中葛根为君药，为豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.) Ohwi的干燥根，多于秋、冬二季采挖。味甘、辛，性凉。归脾胃肺经，具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻的功效。临床多用于外感发热、口渴、消渴等症[1]。现代药理学研究表明，葛根素能够减少Ⅱ型糖尿病模型小鼠体内蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、真核起始因子 2a(eIF2a)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)含量，降低肾脏内质网应激性，达到降低血糖作用[2]。葛根总黄酮通过降低Ⅱ型糖尿病模型大鼠体内血清中还原型谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮合成酶(NOS)等含量，提升胰腺组织相关蛋白酶表达，达到降低血糖、血脂作用[3]。

中药方剂大多以传统的汤剂剂型为主，然而汤剂在煎煮前需浸泡，煎煮过程中需控制煎煮时间及次数，遇到特殊中药材需用特殊的方法进行煎煮，并且汤剂在服用时具有口感差、服用量大、易变质、携带不便等缺点，给现代生活节奏越来越快的人们带来了诸多不便。为了方便患者服用，适应时代的发展，我院药剂科制剂室对汤剂剂型进行改良，研制了葛芪平渴丸，方便患者的服用与携带，市场前景广阔，具有开发意义。为保证葛芪平渴丸的质量，本研究从薄层色谱法、高效液相色谱法两方面入手，制定该制剂的质量标准，为临床安全用药提供理论基础和科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)、YP5002电子天平(瑞士梅特勒仪器有限公司)、DYQC型医用超声波提取器(连云港欧倍洁医疗设备有限公司)、DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)、HH-2电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)、ZF-20D型暗箱式紫外分析仪(上海光豪分析仪器有限公司)。

1.2 试药 葛根素对照品(批号：110752-201514)。葛根对照药材(批号：121551-201601)、薏苡仁对照药材(批号：121254-201203)、黄连对照药材(批号：120913-201109)均由中国药品生物制品检定所提供。甲醇为色谱纯(天津欧密科试剂公司)、其他所用化学试剂均为分析纯、娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别[4]

2.1.1 葛根[5-7]取适量葛芪平渴丸置于研钵中，研细，称取粉末10.7 g，置于具塞的锥形瓶中，量取并加入甲醇30 mL，放入超声仪，20 min后取出，取滤液蒸干，精密量取甲醇0.5 mL使残渣溶解，即为供试品溶液。称取葛根对照药材0.8 g，葛根对照药材溶液的制备方法同上。再取不含葛根的其他药材，同样品制备工艺制备葛根阴性对照样品，称取阴性对照品10.5 g，同法制成葛芪平渴丸葛根阴性对照品溶液。参照(《中国药典》2015年版四部通则0502)，精密吸取供试品溶液、葛根对照品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开剂的比例为：三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结果如图1所示。

2.1.2 薏苡仁[8]葛芪平渴丸放于研钵中，研细，准确称取粉末 25.3 g，置于具塞的锥形瓶中，量取并加入石油醚(60～90 ℃)100 mL，超声仪 30 min后取出，取滤液蒸干，精密加入石油醚(60～90 ℃)1 mL使残渣溶解，即为供试品溶液。称取薏苡仁对照药材1.2 g，薏苡仁对照药材溶液制备方法同上。再取除薏苡仁药材外的其他药材，按处方中药味比例及葛芪平渴丸的工艺制成阴性对照品，称取阴性对照品25.6 g，同葛芪平渴丸供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，准确吸取上述三种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-醋酸(25∶5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。如图2所示。

2.1.3 黄连[9-10]葛芪平渴丸研细，称取粉末20.3 g，放入具塞的锥形瓶中，量取并加入50 mL甲醇，冷浸1 h后，取滤液低温蒸干，精密加入甲醇1 mL溶解残渣，即为供试品溶液。称取黄连对照药材2.4 g，黄连对照药材制备方法同上。再取不含黄连的其余药材，按处方中药味比例、工艺制成不含黄连的阴性样品，称取阴性对照品20.6 g，同葛芪平渴丸供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，分别吸取供试品溶液、黄连对照药材溶液、阴性对照品溶液各5 μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)为展开剂，在另侧槽中加入与展开剂等体积的浓氨试液，预平衡15 min，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果如图3所示。

1～3.供试品 4.薏苡仁对照药材 5.薏苡仁阴性对照品溶液图2 薏苡仁TLC色谱

1～3.供试品 4.黄连对照药材 5.黄连阴性对照品溶液图3 黄连TLC色谱

2.2 含量测定[11-15]

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Thermo C18(5μm，250 mm×4.6 mm)；流动相：甲醇-水(25∶75)；检测波长：250 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；理论板数按葛根素计算应不低于：3000。

2.2.2 制备葛根素对照品溶液 精密称取葛根素对照品2.45 mg，置于25 mL容量瓶中，30%乙醇溶解，定容至刻度，制成每50 mL含4.92 mg的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取适量样品研成细粉，精密称取1.0275 g，放于具塞锥形瓶中，精密移取并加入50 mL 30%乙醇溶液，密塞，准确称量并记录，放入超声仪中，30 min后，取出，放至室温，称量并记录，用30%乙醇溶液补足超声损失的重量，充分摇匀，取续滤液，即为供试品溶液。

学者们一般看重钺体现礼制这方面的功能，这诚然不错，但不能忽视钺还是重要的舞具，中国古代，歌舞乐三位一体，总称为乐。礼与乐共同构成中国古代的政治文化。礼别异，强调的是社会上人的等级，以维护统治阶级的威权和地位；而乐则重在和乐人们的情感，让社会各色人等在同乐的情景下实现和谐。

2.2.4 阴性干扰试验 取不含葛根的其余药材，按处方中药味比例、工艺制成不含葛根的阴性样品。再根据“2.2.3”项下方法制备阴性对照品溶液。精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪，设定方法，测定。根据液相色谱图，阴性对照品在葛根素相对保留时间处未见色谱峰，阴性対照液色谱中则无此峰，结果显示阴性样品对该方法检测几乎无干扰,如图4所示。

2.2.5 线性关系考察 分别精密吸取葛根素对照品溶液(C=0.098 mg/mL)1、2、3、4、5 mL，置于5 mL容量瓶中，以30%乙醇溶解并定容至刻度。分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积。以葛根素的进样量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=4976.5X-40.04，r=0.9998(n=6)，结果表明，葛根素在0.196～0.980 μg范围内，峰面积线性关系良好，线性回归曲线如图5所示。

2.2.6 稳定性试验 取批号为150112的葛芪平渴丸，制备供试品溶液，分别于 0 h、4 h及 8 h，精密吸取供试品溶液 10 μL，按拟定色谱条件，测定葛芪平渴丸中葛根素的峰面积，结果葛根素峰面积值的RSD%=1.51%。结果表明，葛芪平渴丸供试品溶液在 8 h内稳定性良好。

2.2.7 精密度试验 取供试品(批号：150112)，按上述供试品制备方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，连续进样6次，记录峰面积，RSD%=0.29%。

2.2.8 重复性试验 取同一批号样品(批号150112)，按拟定的样品制备方法制备6份供试品溶液，依法测定含量，RSD%=1.46%。结果表明，本方法重复性良好。

2.2.9 回收率试验 按加样回收法进行试验，取样品(批号150112)已知含量(葛根素3.1504 mg/g)的供试品适量，分别加入适量的葛根素对照品，按供试品制备方法制备，测定峰面积，以下式计算回收率。结果见表1。

表1 回收率试验结果

结果表明，本方法回收率良好。

2.2.10 样品测定 取葛芪平渴丸三批样品(批号分别为：150112、150114、150116)，按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，依照上述色谱条件测定其含量。结果见表2。

表2 葛根素的含量测定结果 (n=3)

薄层色谱(TCL)葛根、黄连、薏苡仁特征斑点清晰，专属性强，阴性无干扰；葛根素含量在0.196～0.980 μg范围内进样量与峰面积线性关系良好(r=0.9998，n=6)，平均回收率为98.68%(RSD=0.68%,n=6)。

根据样品测定结果，结合本制剂工艺及药材含量，暂定本品每克含葛根以葛根素(C21H20O9)计，不得少于2.50 mg。

3 讨论

本实验考察了甲醇、50%乙醇、30%乙醇等不同溶剂提取效果[16-18]，结果显示：甲醇、50%乙醇、30%乙醇超声30 min，制备的供试品中葛根素的含量几乎相同，依照优化工艺及节省资源的原则，结合《中国药典》2015年版一部，选用30%乙醇作为供试品的制备溶剂。

本实验还考察了15 min、30 min、45 min等不同超声时长的影响因素，结果显示：超声30 min制备的供试品中葛根素的含量最高，故确定30%乙醇超声30 min作为制备葛芪平渴丸供试品溶液的方法。

本试验对处方中葛根、黄连、薏苡仁三味中药材进行薄层色谱鉴别，对处方中君药葛根指标性成分葛根素进行含量测定，从而建立该制剂的质量标准。该试验方法操作简单、重复性高，结果稳定，可用于同种剂型中药制剂的质量检测。目前大多数中药制剂主要从薄层色谱定性鉴别和高效液相色谱法含量检测两方面入手，选取制剂处方中的部分药材进行检测，制定其质量标准。

近年来，随着中药制剂的现代化发展及院内制剂的开发，高效液相色谱法广泛用于中药材有效成分的含量检测，但该方法并不是检测药品有效成分含量的唯一方法，气相色谱法、液-质联用法、GC-MS联用法、薄层色谱扫描法、核磁共振波普法等检测方法逐渐运用到中药有效成分含量的检测当中，各种方法均具有其优缺点；中药制剂主要为复方制剂，以辨证论治为基础，根据中医药理论组方而成，大多数的院内制剂，为临床使用的经验方，长期临床应用疗效显著，不良反应小，深受患者的好评，为了方便患者的服用及携带，中药汤剂被逐渐改良为现代剂型，这就对中药制剂的质量要求也越来越高，由于中药材成分复杂，检测过程中易产生干扰，中成药中有效成分的检测更是如此，要求我们优化供试品的制备方法，以节省资源、降低干扰成分、易操作为原则，采用不同的方法，检测中药制剂中有效成分及其含量范围，对确保中药制剂的质量及稳定性生产具有重要意义。

葛芪平渴丸是我院脾胃肾病科名老中医的经验方，由葛根、黄连、薏苡仁、熟地黄等十四味中药材组成，其作用是处方中各味中药材共同作用的结果，且中药有效成分复杂多样，为了更进一步研究发挥作用的有效成分及物质基础，在今后的试验研究中，应从处方中各味中药材入手，根据中医药理论及药物之间的配伍关系，运用多种检测方法对其进行研究，从而制定更完善的质量标准，为临床安全使用提供可靠的数据和试验研究资料。