自噬相关蛋白在肝泡型包虫病中的表达及意义※

苏 伟，赵明恩，阳丹才让，樊海宁，王海久☆

(1.青海红十字医院肝胆外科；2.青海大学附属医院肝胆外科)

自噬是一种程序性死亡方式，是指体内多余的蛋白质和亚细胞成分在溶酶体内降解的复杂过程。目前，肝泡型包虫病(Alveolar Echinococcosis，AE)的发生发展过程中是否有自噬的参与尚不清楚。因此，本研究通过在组织样本中检测哺乳动物雷帕霉素(mammalian rapamycin，mTOR)、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)及bcl-2同源结构域蛋白(bcl-2 homeodomain protein，Beclin-1)自噬相关蛋白的表达情况，初步探讨自噬与AE之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

收集青海大学附属医院2018年1月至2018年12月期间收治确诊为AE患者21例，平均年龄33.5±13.0岁，男性12人，女性9人。取研究对象正常肝组织及病灶边缘组织标本。病灶边缘组织取材是指距离病灶边缘2 cm以内的组织；正常肝组织取材来自距离病灶边缘3 cm以外的肝脏组织标本[1]。

1.2 统计学方法

采用SPSS23.0软件进行统计学分析。使用Tissue FAXS PLUS全景组织细胞定量系统对免疫组化结果进行量化分析。采用配对数据t检验分别分析HAE病灶边缘肝组织和正常肝组织LC3、mTOR、Beclin-1表达强度值之间的差异，采用Pearson相关分析系统分别分析HAE病灶边缘肝组织和正常肝组织组LC3、mTOR、Beclin-1表达强度值之间的相关性。检验水准为α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果

HE染色结果如图1所示。图1A可见AE病灶边缘带区域(黑色箭头所示)；病灶纤维结缔组织及坏死区(白色细箭头所示)；图1B为正常肝组织HE染色结果。

A：AE边缘带HE染色图(×100)；B：正常肝细胞HE染色图(×100)

图1AE病灶边缘组织及正常肝组织HE染色图

Figure1The AE lesion edge tissue and normal liver by HE staining DMAC

2.2 免疫组化染色结果

2.2.1 LC3、Beclin-l、mTOR蛋白在AE病灶边缘组织和正常肝组织中的表达水平比较

用Tissue FAXS PLUS全景组织细胞定量系统定量LC3、Beclin-l、mTOR蛋白表达强度值：AE病灶边缘肝细胞组织中LC3蛋白的表达平均强度值为26.21±12.65，正常肝组织为12.65±10.38，差异有统计学意义(P=0.001)；AE病灶边缘肝细胞组织中Beclin-1蛋白表达平均强度为22.50±14.07，正常肝组织为13.48±9.03，差异有统计学意义(P=0.031)；AE病灶边缘肝细胞组织中mTOR蛋白的表达平均强度为13.93±10.54，正常肝组织为41.28±16.34，差异有统计学意义(P<0.001)(见图2、表1)。

2.2.2 AE病灶边缘肝组织和正常肝组织中LC3、Beclin-l、mTOR蛋白表达强度间的相关性分析

在AE病灶边缘肝组织中LC3蛋白表达强度值与mTOR蛋白表达强度值呈负相关(r=-0.471，P=0.031)；Beclin-1蛋白表达强度值与LC3、mTOR蛋白表达强度值无相关性(见表2)。正常肝组织的LC3、Beclin-1、mTOR蛋白表达强度值之间均无相关性。

A：AE病灶边缘肝组织免疫组化LC3高表达图(×200)；B：正常肝细胞免疫组化LC3高表达图(×200)；C：AE病灶边缘肝组织免疫组化Beclin1高表达图；D：正常肝细胞免疫组化Beclin-1低表达图(×200)；E：AE病灶边缘肝组织免疫组化mTOR低表达图(×200)；F：正常肝组织mTOR高表达图(×200)

图2LC3、Beclin-l、mTOR蛋白在AE病灶边缘组织和正常肝组织中的表达图

Figure2Expression of LC3，Beclin-1，and mTOR proteins in AE lesion edge tissue and normal liver tissue

Table 1 Expression of LC3，Beclin-1 and mTOR in the edge of AE lesions and normal liver

*：P<0.05，差异具有统计学意义

表2AE病灶边缘组织LC3、Beclin-1、mTOR表达相关性结果

Table 2 Correlation among LC3，Beclin-1，and mTOR expression in the edge of AE lesions tissues

*：P<0.05，差异具有统计学意义

3 讨论

自噬即溶酶体介导的细胞内物质的降解过程，使一些损伤或错配的蛋白、衰老的细胞器在溶酶体内降解进而维持细胞稳态或基因组的完整性[2]。研究表明，自噬与多种良恶性疾病相关[3-8]。在急性肝损伤、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝缺血再灌注损伤以及肝癌等疾病都可观察到自噬的异常[9]。泡型包虫病进展过程与机体免疫系统相互作用，在这种刺激作用 下是否会导致自噬？本研究结果显示，自噬相关蛋白在AE边缘组织较正常肝组织表达升高，提示自噬可能参与AE的发病过程。

自噬过程是由多种重要的蛋白通过不同的分子途径进行调控。其中自噬相关蛋白LC3在泛素样蛋白加工修饰过程中起重要作用，而LC3修饰过程对自噬泡的形成必不可少，稳定存在于形成的自噬体内膜和外膜上，LC3是目前研究最多的自噬标志性基因之一[10，11]。此次我们通过免疫组化试验提示，LC3蛋白在正常肝组织及AE病灶边缘肝组织中都存在不同程度的表达，而在AE病灶边缘肝组织LC3蛋白表达增强，提示AE病灶边缘肝细胞自噬增多，并且我们通过分析LC3表达强度值与临床因素的相关性发现：LC3表达强度值与TB成负相关，TB是反映肝细胞功能的重要指标之一，TB的升高提示肝细胞受损，因此我们推测可能AE病灶边缘肝细胞LC3的增多对肝细胞可能起到保护作用，并且在一些实验中已经证实了自噬在急性肝损伤、病毒性肝炎、急性酒精性肝炎中起到保护肝细胞作用[12，13]。但是目前还不能完全确定自噬的增多的意义。

本研究中，Beclin-1蛋白在正常肝组织及AE病灶边缘肝细胞中都存在不同程度的表达，其在AE病灶边缘肝组织中表达增强，与LC3在HAE病灶边缘肝组织中表达增强相符合，但两者不存在相关性。有研究表明 Beclin-1与LC3并不一定存在良好的相关性[14]，但不可否认Beclin-1在自噬体形成中的重要作用。另外我们的研究结果显示，在病灶单发组Beclin1表达强度值显著大于病灶多发组，提示低表达的Beclin1可能与AE肝内多发浸润的机制有关。事实上已有研究表明缺失或低表达的Beclin-1提示肝癌、肾透明癌、胃癌预后不良[15]，不过需要指出的是也有一些研究得出了相反的结论[16]，这也体现了自噬形成过程调控机制的复杂性。

mTOR在自噬调节中起核心作用，是调节细胞自噬上游信号转导通路的汇合点，mTOR磷酸化抑制自噬起始分子ULK1，抑制自噬的发生，是自噬的负调控分子[17-20]。我们的免疫组化实验结果显示：mTOR蛋白在AE病灶边缘肝细胞中及正常肝细胞中也都存在不同程度的表达，mTOR蛋白在HAE病灶边缘的肝组织中表达强度降低，并且HAE病灶边缘肝组织中LC3蛋白表达强度值与mTOR蛋白表达强度值成负相关。因此我们推测在AE病灶边缘肝组织中可能因为mTOR受到抑制，而对自噬的抑制作用降低，从而导致LC3蛋白表达增强。