不同时段雄性大鼠循环microRNA-29b的表达量与骨折损伤时间的关系※

高如阳，单中书，吴 岳，郝尔娃，保广年，邓 磊，陈亮

(1.青海大学医学院，青海省 西宁市 810000；2.青海省人民医院，青海省 西宁市 810000；3.青海省公安厅刑事技术研究管理中心，青海省 西宁市 810000)

循环microRNA作为一类非编码的小RNA，具有一定的生物学标记物特征，可以在血清、血浆等体液中稳定存在[1]。有体外细胞实验研究表明microRNA-29b[2，3]通过多种通路参与到骨的形成过程，与骨折损伤修复密切相关，但无量化关系。本研究建立大鼠股骨骨折模型，采用RT-qPCR检测血浆microRNA-29b相对表达量等方法探究其与骨折损伤时间的关系。

1 材料与方法

1.1 动物

1.1.1 实验动物分组

成年SD雄性大鼠(45只，体重280±30g)购于甘肃中医药大学，生产许可证号：SCXK(甘)2015-0002。于中国科学院西北高原生物研究所SPF级动物房适应性饲养7 d(自由进食)。将SD大鼠随机分为空白对照组(5只)、假手术组(20只)和手术组(20只)。假手术组和手术组按照损伤时间各分4个小组(1、4、7、14d组。每组5只)。

1.1.2 大鼠股骨骨折模型的建立

手术组采用开放性截骨术致股骨中段横行离断骨折，建立大鼠股骨骨折动物模型[4]；假手术组仅切口、缝合。以10%水合氯醛(0.4mL/100g)行腹腔注射麻醉，切口选在大鼠左下肢股外侧，沿股外侧肌间隙钝性分离至股骨干，手术组在股骨中段处用线锯锯断造成横行骨折，用生理盐水冲洗伤口，分层缝合切口，以碘伏消毒。假手术组直接用生理盐水冲洗伤口，分层缝合切口，以碘伏消毒。

1.1.3 样本采集

空白对照组在0 d，假手术组与手术组按其分组分别于术后1、4、7、14 d取出股骨用甲醛固定行脱钙处理。腹主动脉取血1.5 mL，离心(12000r/min，4℃)10 min，取上层血浆组织冻存(-80℃)。

1.2 试剂与仪器

试剂：无水乙醇(上海广诺化学科技有限公司)，苏木素、伊红(上海诚凛生物科技有限公司)，中性树脂、4%多聚甲醛(北京Solarbio公司)，盐酸(洛阳昊华化学试剂有限公司)，甲酸(天津市光复科技发展有限公司)，食盐(青海省盐业股份有限公司)，氯仿(上海中泰化学试剂有限公司)，miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute 增强型miRNA荧光定量检测试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]。

仪器：Thermo Print Mate150型组织盒书写仪、Leica TP1020全自动脱水机、Leica EG1150石蜡包埋机、Leica RM2126轮转式切片机(德国Leica公司)，SCILOGEXD1008E掌上离心机(美国SCILOGEX公司)，Eppendorf Centrifuge 5424 R离心机、Eppendorf Mastercyclerpro S梯度PCR仪(德国eppendorf公司)，F6/10匀浆机(上海净信科技)，ABI 7500RT-q PCR仪(美国ABI公司)。

1.3 血浆microRNA的提取及q-PCR分析方法

取200 μL血浆加入900 μL裂解液MZL，按miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒说明书提取血浆microRNA。用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒对上述microRNA进行反转录。反应体系：microRNA 8 μL，2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL，miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 10 μL；反应条件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min，得到cDNA。以miR-29b[5]为目的基因(序列：F：GCGGCGGCTGGTTTCACATGGTG R：ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG )、U6[6]为内参基因(F：TGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTC，R：CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC。由天根生物公司合成)。用miRcute 增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)进行 RT-qPCR反应。反应体系(20μL)：2×miRcute Plus miRNA PreMix(SYBR&ROX)10 μL，Forward Primer(10μM)0.4 μL，Reverse Primer(10μM)0.4μL，miRNA第一链cDNA模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。用ABI 7500 RT-q PCR仪进行扩增，反应程序：95 ℃ 15 min，1个循环；94 ℃ 20 sec，60 ℃ 30 sec，72 ℃ 34 sec，5个循环；94 ℃ 20 sec，60 ℃ 34 sec，40个循环。每个样本设置三个复孔。Ct值由7500 Software v2.0.6软件测得。

1.4 统计学方法

以microRNA-29b为目的基因，以假手术组和手术组为处理组，空白对照组为对照组。将目的RNA分子的Ct值进行2-ΔΔCt[ΔΔCt=(Ct目的RNA-Ct内参)处理组-(Ct目的RNA-Ct内参)对照组]转换，用SPSS 软件进行单因素方差分析(α=0.05)。对手术组microRNA-29b的ΔCt(ΔCt=Ct目的RNA-Ct内参)与骨折损伤时间进行曲线回归分析。

2 结果

2.1 大鼠股骨骨折造模及HE染色结果(图1)

成功建立大鼠股骨骨折模型(图1A)。镜下观察：正常骨组织无异(图1B)；骨折后1 d可见骨膜肿胀、髓腔出血并出现急性炎症(图1C)；4 d可见纤维性骨痂形成(图1D)；7 d可见透明软骨形成并开始骨化(图1E)；14 d可见骨性骨痂形成(图1F)。

A：Open fracture model of femur；B：HE staining of normal bone tissue(×400)；C：1 d，D：4 d，E：7 d，F：14 d HE staining of bone tissue at different fracture time(×400)

图1大鼠股骨骨折造模及HE染色图

Figure1Establishment of rat model of femur fracture and HE staining

2.2 microRNA-29b相对表达量2-ΔΔCt与骨折损伤时间的单因素方差分析结果(表1)

Table 1 Relative expression levels of microRNA-29b at different fracture

*：与同组0 d比P<0.05；△：手术组与假手术组比P<0.05(配对样本t检验)

图2 microRNA-29b的相对表达量随骨折损伤时间的变化趋势图

2.3 手术组microRNA-29b的ΔCt值与损伤时间的曲线回归分析结果(表2，图3)

对骨折后的血浆microRNA-29b的ΔCt值进行回归曲线分析，以骨折损伤时间为自变量X，microRNA-29b的ΔCt值为因变量Y，进行回归方程分析。

表2microRNA-29b的△Ct值与骨折损伤时间的回归模型

Table 2 Regression model between △Ct values of micro RNA-29b and fracture time

图3microRNA-29b的△Ct值与骨折损伤时间的回归曲线图

Figure3Regression curve between △Ct values of microrna-29b and fracture time

3 讨论

本研究结果显示，循环microRNA-29b的表达量在骨折损伤时间内呈现递减趋势，可以作为雄性大鼠短期骨折损伤时间推断的指标。

近年来，各种影像学技术(X线[7]、CT[8]、MRI[9]等)应用于骨折损伤时间的推断[10]，可以区分出新鲜骨折(2～3w)与陈旧性骨折(3w以上)，但不能准确推断骨折时间[11]。各种因素影响也给骨折损伤时间的推断带来了难度。在法医工作中，骨折损伤时间的鉴定对案件起着决定性作用，因此需要研制一种更加客观精确的鉴定技术。

骨折的修复主要经历血肿形成、纤维性骨痂形成、骨性骨痂形成以及骨痂改建或再塑四个阶段，短期骨折损伤的修复主要涉及前三个阶段。显微观察：大鼠股骨骨折后1 d骨折断端出血、大量炎症细胞浸润及血肿形成；4 d血管、纤维组织增生，纤维性骨痂形成；7 d皮质区附近出现透明软骨组织、成骨细胞和新生的骨小梁；14 d纤维性骨痂逐渐被骨性骨痂取代，根据病理学的改变选择1、4、7、14 d这四个时间点进行短期骨折损伤时间的推断。而大鼠作为骨折损伤研究中常用的动物模型，具有重复性高、可操作性强的特点，所建立的开放性股骨骨折模型的骨折部位及类型相同，并且对周围的肌肉、血管等损伤小[12]，因此可以更好地观察骨组织损伤的改变。

近年来，应用ELISA(酶联免疫吸附试验)、FCM(流式细胞术)、RT-qPCR等技术检测血液中与骨病及骨折相关蛋白、细胞及基因的研究已成为热点[13]。由于miRNA在多种体液内稳定存在、血液样本较容易提取的特点，使其在医疗及法医鉴定领域具有巨大的潜力。如今microRNA在骨折损伤领域的研究越来越多[14]，而microRNA-29b作为microRNA-29家族[15，16]中的关键分子，在骨分化过程中发挥着重要的作用。Li Zhaoyong[17]、Navya[18]等通过微阵列芯片筛选发现microRNA-29b与骨代谢高度相关，作为一种重要的调节因子参与成骨细胞分化，并对细胞外基质的产生起着重要的调节作用。Liu[19]、Marco[20]和马钢[21]等的研究分别发现microRNA-29b的表达量增高会抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化、抑制破骨细胞的活性、抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞及成软骨细胞的分化。本实验研究显示，microRNA-29b的相对表达量随着骨折损伤时间的增加逐渐降低，在一周内下降幅度较大，后逐渐变缓，与骨折损伤时间高度相关。通过回归分析，建立的三次方程回归系数更大，更适合于骨折损伤时间的推断。结合镜下观察结果，骨折损伤后成骨细胞一直处于活跃的增生状态，参与骨组织的形成，促进钙化。破骨细胞发挥吸收功能，在软骨内成骨阶段，逐渐分解钙化的软骨组织。综上所述，microRNA-29b与骨的修复呈负调节关系(可能是通过对成骨细胞、破骨细胞的调节来参与骨折修复)。

有研究表明microRNA-29b除了与骨代谢密切相关之外，还与肿瘤[22]、糖尿病[23]等疾病相关。因此，其作为骨折损伤检测指标还需考虑上述因素。此外，本实验结论只针对短期、成年雄性大鼠的股骨骨折，对人类骨折时间推断的适用性尚需明确。