六株甘蔗根际固氮细菌的鉴定及其促生特性检测

杨建波 彭鑫华

（广西百色学院农业与食品工程学院 533000）

甘蔗（Saccharum officinarum）是一种一年生或多年生的草本科植物，属C4作物。甘蔗中含有丰富的糖分，是制造蔗糖的原料，还是重要的能源作物（黄东杰和孙继华，2012）。糖是人类必需的食品之一，也是食品工业的重要原料。在世界食糖总产量中，蔗糖约占65%。巴西、印度和中国是最大的甘蔗种植国家。中国甘蔗主要种植区在南方。广西地处亚热带季风气候区，热量丰富，雨水充沛，季节变化不明显，日照适中，冬短夏长，自然条件很适合甘蔗的种植（侯佳，2012）。2015年，广西蔗糖产量约为902万t，广西占全国蔗糖产量的62.70%。

Döbereiner于1975年在禾本科植物根际中发现Azotobacter paspali，确认了一类依赖植物根系分泌物生存繁殖，定植于禾本科植物根际，或近根土壤，能自由生活的具有固氮能力的细菌，并由此提出禾本科植物根际固氮概念，即现在所说的联合固氮作用（黄东杰和孙继华，2012）。巴西的研究者发现甘蔗的低氮种植不会造成土壤的含氮量下降，因此，他们认为生物固氮可以促进甘蔗的生长，并开始研究甘蔗固氮的机理（陈文新和汪恩涛，2011）。甘蔗根际固氮菌的固氮量占甘蔗生长所需总氮量比值高达60%～70%；除此以外，甘蔗根际固氮菌能分泌合成植物生长调节剂促进甘蔗生长，如吲哚乙酸、赤霉素等，能刺激根系生长，从而促进作物对其他矿质元素的吸收（王春红等，2015）。联合固氮菌能分泌某些物质，使土壤中不易被植物体直接吸收的有机和无机磷转化为能直接被宿主植物吸收利用的状态（沈世华和荆玉祥，2003）。磷和钾是植物生长过程中必不可少的元素，固氮菌的溶磷解钾特性能促进宿主植物更好的生长。甘蔗根际固氮菌同时还具有生物防治作用，研究发现甘蔗根际固氮菌在长期的进化历程中始终与甘蔗共生，其共生状态不但不会对甘蔗的生长造成不良影响，还会因为其占据生态位置而使有害病菌在营养物质、生存空间等的利用上受到竞争，从而达到抑制有害病菌生长和保护甘蔗的作用。不仅如此，固氮菌还能提高某些酶的活性，增强与氮同化和有机磷分解有关的酶的活性。这些生理变化也增强了寄主根系对病原体的抵抗力（王春红等，2015）。

在甘蔗生产过程中，高氮肥的投入虽然可以为实现增产提供帮助，但同时也增加了甘蔗的生产成本，从长远的可持续发展观来看，长期大量施用化肥，容易导致病虫害加剧，造成环境污染（沈世华和荆玉祥，2003）。这些弊端不仅会影响我国现代化农业的可持续发展，还会降低我国蔗糖业的国际竞争力，对地方财政和蔗农脱贫致富造成不利影响（邢永秀等，2010）。充分挖掘生物固氮的潜能，能够有效的减少甘蔗生产过程中氮肥的施用量。生物固氮既可以为甘蔗生长提供所需的氮素，也不会造成环境污染和土壤生产力下降（张洪彬，2016）。因此，从不同生境下的甘蔗根际分离固氮细菌，通过形态学、16S rDNA序列比对等进行分类鉴定，并通过检测供试菌株分泌IAA、溶磷解钾等生物活性筛选拥有促生潜力的优质菌株，可为进一步挖掘生物固氮微生物资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

六株分离自甘蔗根际的固氮细菌，编号41、42、43、44、45、46。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化及革兰氏染色检测（胡春锦等，2012）。固氮菌接种于Döbereiner固体培养基平板上进行活化，28℃恒温培养12～24 h后观察单菌落特征，挑取单菌落进行革兰氏染色并观察。

1.2.2 16SrDNA基因序列的扩增。参照周发俊的方法（周发俊，2009）进行供试菌株的16S rDNA基因序列的扩增。目的基因片段的回收参照凝胶DNA回收试剂盒（杭州新景生物试剂有限公司）的说明书。

1.2.3 系统发育树的建立（康贻军等，2010；薛庆中，2012）。将测序得到的目的序列在NCBI数据库中进行比对，下载参考序列，再用DNAMAN 7.0生物软件建立系统进化树。

1.2.4 分泌植物生长素测定。采用Salkowsk比色法检测6株供试固氮菌分泌生长素的能力（张洪彬，2016）。

1.2.5 溶磷、溶钾能力定性试验。参照王钱崧固氮细菌溶磷能力定性试验方法（王钱崧，2013）。

2 结果与分析

2.1 供试菌株的菌落形态

图1 甘蔗根际固氮菌的菌落形态

表1 菌落的形态特征

将供试固氮菌划线接种Döbereiner固体培养基上28℃条件下培养24 h以上，菌落菌落形态特征如图1、表1所示。

2.2 供试菌株的的革兰氏染色及镜检

经过革兰氏染色，结果显示供试菌株均为革兰氏阳性细菌，染色结果见图2，显微形态特征见表2。

表2 革兰氏染色结果及显微形态特征

图2 革兰氏染色镜检结果（1000×）

2.3 供试菌株的16S rDNA序列片段扩增

16S rDNA片段的扩增，如图3所示，可以看到明亮清晰的条带，大小在约在1500 bp左右，说明成功扩增到目的片段。

图3 甘蔗根际固氮菌菌株16S rDNA的扩增

2.4 供试菌株16S rDNA序列的系统发育分析

把测序得到的目的基因序列在NCBI中进行Blast，与参考序列一起构建系统进化树（见图4），从中可以看到，42与46首先聚为一支，41、43、44和45与多个枯草芽孢杆菌首先聚为一支，由此可以推断六个菌株均为芽孢杆菌属，其中41、43、44和45为枯草芽孢杆菌。

图4 供试菌株16S rDNA序列系统进化树

2.5 供试菌株分泌生长素特性检测

供试菌株分泌IAA的显色反应测定结果表明，供试的6株固氮菌均具有分泌IAA的特性（见图5）。

图5 IAA标准浓度梯度液（上）与供试菌株反应液（下）的显色结果

2.6 供试菌株溶磷、解钾特性检测

溶磷、解钾试验结果显示，供试6株固氮菌在Pikovaskaia’s和Ashby平板培养基上均有透明圈出现(图6、图7)，即6株供试固氮细菌均具有溶磷解钾的特性（表3）。

图6 供试固氮细菌的溶磷特性检测结果

图7 供试固氮细菌溶钾特性检测结果

表3 固氮菌株的促生特性检测结果

3 讨论

将从甘蔗根际分离得到的6株固氮细菌，在Döbereiner低氮平板上诱导纯化后菌落形态特征基本一致。经革兰氏染色后确定41、42、43、44、45、46这6株菌均为革兰氏阳性菌，在1000倍镜下观察单个菌体的形态均为杆状。构建系统进化树，可以看到42号、46号菌株首先与芽孢杆菌属的某些菌株聚在同一个分支上，而41号、43号、44号和45号菌株则与枯草芽孢杆菌聚在一个分支上，这也与菌落形态、革兰氏染色等结果相吻合。因此，可以推断六个供试菌株均为芽孢杆菌属细菌，其中41号、43号、44号和45号菌株为枯草芽孢杆菌。经定性试验检测，六个固氮细菌菌株在分泌IAA、溶磷和解钾的特性方面均呈阳性（见表3），显示出明显的促生特性，与芽孢杆菌的特性相当一致，这一研究结果可为甘蔗联合固氮研究及生产应用提供参考。