马钱子-白芍配伍贴膏剂的制备与经皮渗透性质研究

★ 赵加茜 朱卫丰 陈丽华 管咏梅 金晨 胡亚

(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004)

马钱子为马钱科植物马钱(nux'vomica L.)的干燥成熟种子，具有通络止痛，散结消肿、镇痛抗炎等功效，其主要有效部位为马钱子总生物碱，其中马钱子碱与士的宁是马钱子总生物碱的主要成分[1-3]。白芍为毛茛科植物白芍(Paeonia lactiflora Pall)的去皮干燥根，具平肝止痛、养血调经、敛阴止汗之功效。研究发现马钱子总碱和白芍总苷具有镇痛抗炎等功效，两药配伍使用可发挥增效作用[4-5]。口服马钱子总碱具有明显的中枢毒性，治疗剂量接近中毒剂量，故经皮给药为其常用的治疗方式。贴膏剂属于缓控释外用制剂，具有载药量大，给药剂量可控，透气性好等优点，但也存在透皮吸收效果较差、不利于精确控制给药剂量和给药时间等问题。促透剂可以调节皮肤通透性，提高药物的经皮渗透速率，以达到提高药物生物利用度的目的，近年来天然中药挥发油类促透剂因其具有效果好、副作用小、无污染等优点，逐渐成为促透剂研究的热点问题[6]。薄荷醇为中药薄荷挥发油中的主要成分，薄荷醇作为促透剂具有较好的促透效果，是目前研究较多的中药挥发油类促透剂[7-8]。本实验制备马钱子-白芍配伍贴膏剂，考察了不同浓度的薄荷醇为促透剂对马钱子-白芍配伍贴膏剂中马钱子总碱体外经皮渗透性的影响，以化学促透剂氮酮为阳性对照，寻找薄荷醇的最佳促透浓度，为提高马钱子总碱的体外经皮吸收提供一定的实验依据。

1 材料

TG328A 型分析天平(德国Sartoius公司)；TK-20B透皮扩散试验仪(上海鍇凯科技贸易有限公司)；TT-6D Franz扩散池(天津正通科技有限公司)；Agilent 1260 型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)。

马钱子总碱(自制，HPLC测定马钱子总碱含量为66.4%)；白芍总苷(芍药苷含量为50%，南昌贝塔生物科技股份有限公司)；马钱子碱对照品(20mg/支，质量分数≥98%，批号：BCGT-0209)；士的宁对照(50mg/支，质量分数≥98%，批号: BCGT-0126)；薄荷醇(质量分数≥99%，上海瑞永生物科技有限公司)；NP-700(国际特品ISP上海分公司)；甘羟铝(日本协和化学有限公司，批号：SG-0344)；甘油(陕西太白山制药有限公司)；柠檬酸(西陇化工股份有限公司)；CMC-Na(上海山浦化工有限公司)；PEG400(西陇化工有限公司)。

清洁级小鼠，体重约22g左右，购自江西中医药大学实验动物中心，许可证号SCXK(赣) 2011-0001。

2 方法与结果

2.1 马钱子-白芍配伍贴膏剂的制备 称取处方量的马钱子总碱、甘油、NP-700、CMC-Na、PEG400溶解于无水乙醇中，白芍总苷、甘羟铝、柠檬酸溶解于超纯水中，两相混合搅拌形成凝胶状，均匀涂布于无纺纱布上，40℃烘干4h，取出凉至室温，表面覆盖防黏膜，即得马钱子-白芍配伍贴膏剂。同法在各基质和药物溶解后将薄荷醇和氮酮溶解于无水乙醇中，可制备含1%，3%，5%薄荷醇和3%氮酮为促透剂的马钱子-白芍配伍贴膏剂。

2.2 马钱子总碱含量测定

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称定马钱子碱对照品0.00126g、士的宁对照品0.00204g，置同一10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得马钱子碱与士的宁混合对照品溶液(每1mL含马钱子碱126μg、士的宁204μg)。

2.2.2 色谱条件 色谱柱为菲罗门Gimini C18(4.6mm×250mm，5μm) ，流动相为缓冲盐溶液( 0.01mol/L庚烷磺酸钠和0.02mol/L磷酸二氢钾等量混合，磷酸调pH2.8) -乙腈= 79:21，流速1mL/min，进样量20μL，检测波长为260nm，柱温30℃。理论板数按马钱子碱峰计算应不低于5000，结果见图1。

A.空白透皮接收液；B.对照品溶液；C.供试品溶液；

2.2.3 标准曲线的绘制 取马钱子碱与士的宁混合对照品母液适量稀释得0.95，1.51，3.24，4.32，10.81，21.60，43.20 μg/mL马钱子碱对照品溶液和1.53，2.04，4.58，9.81，13.08，32.70，65.40μg/mL对照品溶液，进样20μL，记录马钱子碱和士的宁峰面积，分别以马钱子碱和士的宁质量浓度(X) 为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行标准曲线线性回归，得马钱子碱回归方程Y=16.751X-1.6542(r=0.9997)，线性范围为0.95～43.20 μg/mL，士的宁回归方程Y= 27.329X- 27.304(r=0.9996)，线性范围为1.53～65.40 μg/mL。

2.2.4 精密度试验 取马钱子碱和士的宁混合对照品溶液，在“2.2.2”色谱条件下连续进样6次，记录马钱子碱和士的宁的峰面积，结果显示马钱子碱和士的宁的峰面积的RSD分别为0.24%，0.18%，均小于5%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验 取同一马钱子碱和士的宁透皮接收溶液6份，在“2.2.2”色谱条件下进样，记录马钱子碱与士的宁的峰面积，并计算RSD，结果表明马钱子碱和士的宁质量浓度的RSD分别为2.58%，0.44%，均小于5%，表明供试品溶液重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一马钱子碱和士的宁透皮接收溶液，在“2.2.2”色谱条件下分别于0，2，4，8，12，24h进样，记录马钱子碱与士的宁的峰面积，结果表明马钱子碱和士的宁质量浓度的RSD分别为0.21%，0.33%，均小于5%，表明马钱子碱和士的宁透皮接收溶液在24h内稳定项良好。

2.2.7 加样回收率试验 取空白基质皮肤透过液9份，分别加入低、中、高质量浓度的马钱子碱和士的宁对照品溶液，每个质量浓度的供试品为3份，在“2.2.2”色谱条件下测定其质量浓度，计算马钱子碱和士的宁的加样回收率，结果马钱子碱低、中、高质量浓度的加样回收率分别为101.87%，99.03%，96.95%，RSD分别为0.45%，0.82%，2.24%；士的宁低、中、高质量浓度的加样回收率分别为104.0%，98.03%，98.42%，RSD分别为1.31%，1.81%，0.29%。

2.3 贴膏剂物理性质评价

2.3.1 粘附力测试 按照《中国药典》2015版规定的粘附力测定法测定贴膏剂的初黏力、持黏力和剥离强度。实验前，将6片马钱子-白芍配伍贴膏剂放置在温度25℃，相对湿度60%的恒温恒湿箱中2h。采用滚球斜坡停止法测定贴膏剂初黏力，将贴膏剂固定在倾斜角30°的倾斜板上，粘性面朝上，以贴膏剂粘性面粘住的最大号钢球评价贴膏剂的初黏力。将贴膏剂黏性面粘贴于试验板表面，垂直放置，沿供试品的长度方向悬挂一规定质量的砝码，记录供试品完全从试验板脱落的时间，评价贴膏剂的持黏力。采用180°剥离强度试验法测定贴膏剂的剥离强度，将贴膏剂粘性面粘接在试验板上，用2kg重压辊在供试品上来回滚压三次后在室温下放置20min后进行剥离强度测定。

实验结果表明，制备的马钱子-白芍配伍贴膏剂能够粘住11号钢球，持黏力测定显示马钱子-白芍配伍贴膏剂的脱落时间≥400s，剥离强度为3.25±0.80N。

2.3.2 赋型性试验 制备好的贴膏剂放置在37℃、相对湿度64%的恒温恒湿箱中30min后，固定在倾斜角为60°的倾斜板上放置24h，观察贴膏剂是否有流淌现象。实验结果表明马钱子-白芍配伍贴膏剂赋型性良好，膏体无任何流淌现象。

2.3.3 综合感官评价 通过盲法评分法对贴膏剂的皮肤膜残留、皮肤追随性、膏体性状和透布程度进行评价。皮肤膜残留：将贴膏剂从皮肤表面掀开后，皮肤表面无残留、膏面无破损者为满分；皮肤追随性：将贴膏剂贴于手背表面，均匀用力甩动三次，贴膏剂均无掉落计满分；膏体性状：膏体软硬适中，涂展性好，无颗粒状胶团和气泡计满分；透布程度：眼睛观察无透布现象记满分。每个项目满分为5分，按照分数分按照等级依次计5、4、3、2、1分，见表1。结果表明，制备3批次的贴膏剂皮肤追随性较好，贴于肤表面膏体无残留，制备的膏体无明显气泡和颗粒状胶团，无明显透布现象。

表1 贴膏剂综合感官评分表

2.4 体外经皮渗透评价

2.4.1 离体皮肤的制备 取健康雄性小鼠，麻醉后用电动剃毛器剃掉腹部毛后剥离小鼠腹部皮肤，生理盐水清洗皮下脂肪组织和粘连物，锡箔纸包裹后-20℃冷冻保存，使用前用生理盐水浸泡自然解冻，皮肤一周内用完。

2.4.2 渗透扩散装置 透皮吸收渗透扩散装置采用改良Franz扩散池。扩散池由两部分组成，上室为扩散室，下室为接收室，接收池容积为12mL，选择20%乙醇生理盐水为透皮接受液，扩散池扩散面积为1.85cm2，水浴循环温度维持在(37.0±0.5)℃，设置转速为150r/min，取样量为1mL。

2.4.3 体外透皮实验 剪取面积大于扩散池表面积的小鼠皮肤，放置在Franz扩散池的供给池与接收池结合处，皮肤角质层朝向供给池，并用弹簧夹固定扩散池和供给池，用20%乙醇生理盐水平衡30min后给药，分别取未加促透剂、1%，3%，5%薄荷醇和3%氮酮为促透剂的马钱子-白芍配伍贴膏剂适量，均匀地涂抹在离体小鼠皮肤表面，使药物与鼠皮充分接触，保持转速与水浴循环温度。于1，2，4，6，8，10，12，24h取1mL接收液(同时补充相同温度的接收液1mL)，将取出的接收液10000r/min的速度离心10min，离心后的上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，在“2.2.2”色谱条件下测定马钱子碱和士的宁的含量，并计算马钱子碱和士的宁的累积透过量Qn，计算公式为：Qn=(Vpn+ ΣpiVii)/A。其中A为有效扩散面积，V为接受液总体积，ρn为第n次取样时接受液中药物的质量浓度，ρi为第i次取样时接受液中药物的质量浓度，Vi为取样体积；以药物的累积透过量Q24(μg·cm-2) 对取样时间t作曲线，并对曲线中的直线部分进行线性回归，求出的直线斜率即为稳态透皮速率Js(μg·cm-2/h) 。利用t检验进行差异显著性比较，结果见图2、图3、表2、表3。

透皮实验结束后取下小鼠皮肤，用生理盐水洗净小鼠皮肤表面的贴膏剂，并剪下给药部分，剪刀剪碎后加入甲醇1mL涡旋5min，超声提取30min，4000r/min离心10min。离心后的上清液用0.22μm微孔滤膜过滤。在“2.2.2”色谱条件下测定马钱子碱和士的宁的含量，计算药物的皮肤滞留量Qs(μg·cm-2)，计算公式为：Qs=Vp/A。结果见表2、表3。

图2 不同马钱子-白芍配伍贴膏中马钱子碱的

2.5 实验结果 结果显示，制备的马钱子-白芍配伍贴膏剂膏体无明显气泡和颗粒状胶团，无明显透布现象，皮肤追随性较好，贴于肤表面膏体无残留，粘附力符合要求，赋型性良好。体外透皮实验显示马钱子碱的24h累积透过量为3%薄荷醇>5%薄荷醇>1%薄荷醇>3%氮酮>阴性对照，士的宁24h累积透过量为3%薄荷醇>5%薄荷醇>3%氮酮>1%薄荷醇>阴性对照，结合图2和图3，表明薄荷醇能够有效促进马钱子-白芍配伍贴膏中马钱子碱与士的宁的体外渗透吸收，3%薄荷醇的促透效果最佳。由表2和表3可知，3%，5%薄荷醇为促透剂时，马钱子碱和士的宁的稳态渗透速率比3%氮酮为促透剂时分别提高了3.64，3.05倍和2.79，2.61倍，表明3%和5%薄荷醇的促透效果优于阳性对照3%氮酮。以薄荷醇为促透剂时，马钱子碱与士的宁的皮肤滞留量均有所增加，表明薄荷醇能够增加马钱子与士的宁的药物储库效应，延长药物的作用时间。

3 讨论

马钱子总碱毒性较大，其毒性机制主要在中枢神经系统和心血管系统，临床上常采用经皮给药的方式使用。马钱子外用制剂能够避免肝脏首过效应，减少马钱子总碱的毒副作用，但传统马钱子外用制剂生物利用度较低，不能确保足够量的药物透过皮肤进入人体内以达到有效的血药浓度。近年来有研究采用脂质体、囊泡等作为马钱子总碱外用制剂的载体，能够提高马钱子总碱的透皮性能，但临床应用较少[9-10]。

马钱子类生物碱属于单萜吲哚类生物碱，马钱子总碱中的主要成分马钱子碱和士的宁是脂溶性药物，相对分子质量较小，但皮肤角质层特殊的“砖墙”结构是马钱子总碱经皮吸收的主要屏障，增加马钱子总碱透过皮肤角质层的速率是提高马钱子总碱的透皮吸收利用的关键[8]。研究表明促透剂能够破坏角质层间隙脂质的有序排列，增加脂质的流动性，提高药物的扩散系数，可逆地改变皮肤角质层的屏障功能，使药物通过皮肤角质层到达靶组织，因此在外用制剂中加入促透剂能够显著提高药物的经皮渗透速率，使药物达到有效的血药浓度[11-14]。薄荷醇是中药薄荷挥发油的主要成分，属于中药萜烯类化合物，与氮酮等化学促透剂相比，薄荷醇具有促透效果好、时滞短、毒性小等优点，是目前研究得最为广泛的中药挥发油类促透剂之一。薄荷醇对脂质分子疏水链具有较好的亲和力，薄荷醇透过皮肤时，皮肤表皮与正常皮肤比较皱褶明显增多，最外层角质层脱落明显，呈带状游离分布，角质层间的氢键网络结构遭到破坏，脂质正常有序的板层网状结构消失，出现明显增厚的紊乱排列和中等致密的凝絮块状结构[16]。FTIR研究分析发现薄荷醇透过皮肤时皮肤脂质碳氢不对称吸收峰和对称吸收峰信息发生改变，推测薄荷醇能够加速表皮角质层的结构变化，可逆性破坏角化细胞间脂质结构，从而导致皮肤对外来药物的阻滞作用降低，使药物更容易经过表皮细胞间空隙扩散。

表2 不同马钱子-白芍配伍贴膏剂中马钱子碱的渗透动力学参数±s,n=5)

表3 不同马钱子-白芍配伍贴膏剂中士的宁的渗透动力学参数±s,n=5)

图3 不同马钱子-白芍配伍贴膏中士的宁的

薄荷醇具有一定的镇痛、抑菌、抗炎的功效，能够兴奋人体中枢神经系统，对神经痛和风湿关节痛具有明显的缓解作用，这与马钱子生物碱镇痛抗炎的药理作用相似，因此选择薄荷醇作为促透剂不仅可以提高马钱子总碱的促透效果，而且还可以起到协同增效的作用，有助于马钱子药效的发挥和疗效的提升[17]。实验结果表明薄荷醇不仅能够提高马钱子总碱的经皮渗透速率，还可以增加马钱子总碱的皮肤滞留量，形成药物储库效应，除去贴膏后仍有药物从皮肤释放，从而可以延长药物的作用时间，这为薄荷醇作为一种促透剂及马钱子总碱外用制剂的处方优化提供一定的实验依据。