HPLC法测定桃仁配方颗粒中苦杏仁苷及其不确定度评价

★ 张晓男魏惠珍, 金浩鑫 吕尚 张丹 肖雄 朱敏 饶毅,

(1.江西中医药大学 南昌 330004；2.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心 南昌 330006)

桃仁，蔷薇科植物桃或山桃的干燥成熟种子，具有活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘的功效[1]。中药配方颗粒是我国传统中药的现代化产物，它免除了传统中药繁琐的煎煮过程，可直接服用，不仅保证了中药饮片的药效，还能够根据中医临床辨证论治，随症加减，受到患者的普遍认可。但是，目前我国仅有6家企业试点且鲜有配方颗粒注册审批，其主要原因是没有建立稳定可控的质量评价体系。

不确定度作为一种科学的统计手段，是与测量结果相关联的、定量说明测量结果质量的一个参数，表征合理地赋予被测量值的分散性[2]。在本实验中，采用测量不确定度的方法，定量评估桃仁配方颗粒中苦杏仁苷含量测定结果的可信度,为建立配方颗粒稳定可行的质量评价体系提供数据依据。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪(Waters，2695-2996);万分之一电子天平(梅特勒，AB-104N);十万分之一电子天平(岛津，AUW-220D);苦杏仁苷对照品(110820，纯度90.7%，购买于中国食品药品检定研究院);桃仁配方颗粒(自制，每克桃仁配方颗粒相当于12g饮片)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：依利特Hypersil ODS (4.6mm×250mm,5μm)；流动相：甲醇-水(20∶80)；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：210nm；进样量：10μL。

2.2 对照品溶液的制备 取对照品约10mg，精密称定置 50mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，再精密量取10mL置25mL量瓶中，用70%甲醇定容，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取桃仁配方颗粒(研细)约0.1g，精密称取置具塞锥形瓶中，精密量取70%甲醇25mL，称重，超声30min，放冷，称重，补重，摇匀，滤过，取续滤液2mL置10mL量瓶中，定容，摇匀，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备 按“2.3”项下方法制备。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察 取阴性溶液、对照品溶液、供试品溶液，按2.1项下色谱条件各进样10μL,测定，见图1。

A:阴性溶液;B:对照品溶液;C:供试品溶液;1为苦杏仁苷

2.5.2 稳定性试验 取供试品溶液一份，分别于0，2，4，8，12，24h各进样10μL，记录峰面积，RSD为1.09%，表明该溶液24h内稳定。

2.5.3 精密度试验 取苦杏仁苷对照品溶液连续进样6次，RSD为0.39%，表明该仪器精密度较好。

2.5.4 线性试验 配制6份不同浓度的苦杏仁苷对照品溶液(0.0078，0.0156，0.0390，0.0779，0.0974，0.1948 mg/mL)，进样10μL，记录其峰面积。纵坐标Y代表峰面积，横坐标X表示苦杏仁苷的浓度，其回归方程为Y=10 221 353.87X-1 784.30(r=0.9999)，说明苦杏仁苷在15.6～194.8μg/mL浓度范围线性良好。

2.5.5 重复性试验 按“2.3”项下方法平行制备6份，进行测定，RSD为0.69%，说明该方法的重现性良好。

2.5.6 加样回收试验 取已知含量的桃仁配方颗粒粉末约0.05g六份，精密称定，分别加入苦杏仁苷对照品(浓度为1.44mg/mL)，按“2.3”项下方法制备。结果显示：回收率99.96%，RSD为0.80%，表明此方法有较好的准确性。

表1 桃仁配方颗粒加样回收率试验结果

3 不确定度评定[3-12]

图2 不确定度因果关系图

3.3 不确定度分量量化 由图2可知，对桃仁配方颗粒含量测定结果产生影响的主要分为对照品引入的不确定度和样品引入的不确定度。

3.3.1 对照品溶液引入的不确定度 对照品引入的不确定度由对照品质量u(mi)、对照品稀释u(Vi)和对照品峰面积u(Ai)组成。

(1)对照品质量引入的不确定度u(mi)

①对照品纯度引入的不确定度 由于对照品只显示纯度，没有给出限度标识，忽略此项。

因为称量是一次归零称量所得，且使用的是自动显示数字的天平在一个很窄的范围内进行的称量，得到的质量差值灵敏度可以忽略不计。

(2)对照品溶液体积引入的不确定度u(Vi)

由“2.2”项下可知，在对照品溶液的配置过程中，对对照品溶液体积贡献不确定度的有50mL量瓶、10mL移液管、25mL量瓶。

(3)对照品峰面积Ai引入的不确定度

3.3.2 供试品溶液引入的不确定度

(1)供试品质量引入的不确定度u(ms)

(2)供试品溶液体积引入的不确定度u(Vi)

(3)供试品峰面积As引入的不确定度

3.4 计算合成不确定度 由上述不确定度分量可知苦杏仁苷含量测定的相对标准不确定度为：

3.5 扩展不确定度 在95%置信概率下取包含因子k=2，则相对扩展不确定度U95(W)=k×u(X)=2×0.0083=1.66%。

实验所测桃仁配方颗粒中苦杏仁苷的含量为142.17mg/g，故其扩展不确定度为:U95=142.17mg/g×0.0166=2.36mg。

3.6 报告不确定度 经过不确定度分析可知，桃仁配方颗粒中苦杏仁苷的测量结果为(142.17±2.36)mg/g。

4 讨论

苦杏仁苷是氰苷类物质，根据其性质，笔者考察了50%甲醇、70%甲醇、甲醇、70%乙醇溶液对桃仁配方颗粒中苦杏仁苷的提取率。结果表明，在70%甲醇和甲醇溶剂中的苦杏仁苷的含量较高。因苦杏仁苷易溶于醇且具有一定的水溶性，故选用70%甲醇溶液作为提取溶剂。后又考察不同提取溶剂量、提取方式和提取时间对桃仁配方颗粒中苦杏仁苷含量的影响，最终采用25mL、70%甲醇、超声30min。

实验过程中每个操作步骤都将会对测定结果产生一定的影响。通过对桃仁配方颗粒中苦杏仁苷含量测定的具体分析，可以看出各个不确定度分量对其含量均有影响。相对而言，供试品溶液的体积对实验结果不确定度贡献最大。在本实验中，我们可以通过减少溶液稀释次数比如供试品溶液的制备过程中可省去“取2mL续滤液加入10mL量瓶”这一步骤，将样品直接称量置100mL量瓶中，另一方面也可尽量使用容量大的玻璃量器比如可将“取2mL续滤液加入10mL量瓶”改为“取10mL续滤液加入50mL量瓶”以降低供试品溶液的体积引入的不确定度。利用不确定度理论对实验过程中每一步骤具体分析，可将对实验结果不确定度贡献较大的某些步骤进行改善，进一步减小测量结果的不确定度。

另外本研究在方法摸索中发现目标峰附近有一杂质峰。查阅15版《中国药典》得知，药典中桃仁和苦杏仁均以苦杏仁苷为指标成分，但桃仁含量测定所用流动相为甲醇-水，提取方式为回流，而苦杏仁含量测定所用流动相是乙腈-0.1%磷酸溶液，提取方式为超声。经深入研究发现，采用甲醇-水时，目标峰中实则包含苦杏仁苷(D-苦杏仁苷)和它的差向异构体(L-苦杏仁苷)两部分，而采用乙腈-0.1%磷酸溶液或者乙腈-水溶液时，可将苦杏仁苷与其差向异构体分离。经实验发现，采用回流提取时，苦杏仁苷的含量下降，而L-苦杏仁苷的含量会有所升高。然而，目前L-苦杏仁苷的生理活性、药理作用、药代动力学及与苦杏仁苷在临床应用的区别等相关方面研究较少，但是苦杏仁苷及其差向异构体在不同的温度、酸碱度及酶等条件下又可相互转化[13-14]，所以桃仁、苦杏仁及郁李仁在进行含量测定时，需将苦杏仁苷与其同分异构体完全分离还是将两者合并测其总含量，有待进一步研究。而在实验操作中应严格控制实验条件如温度、酸碱度、湿度等对结果的影响，以减小引入的不确定度。

本文根据不确定度理论，对桃仁配方颗粒中苦杏仁苷的含量测定进行不确定度评价，得到其合成不确定度为0.83%，在95%的置信区间下含量测定的扩展不确定度为2.36mg，桃仁配方颗粒中苦杏仁苷的测量结果为(142.17±2.36)mg/g。测量不确定度可以定量的描述实验结果的可信度，能作为桃仁配方颗粒中苦杏仁苷定量测定结果的一种补充，并为其他中药配方颗粒的质量控制研究提供有效参考。