多潘立酮自乳化软胶囊Beagle犬体内药物动力学研究

★ 朱烨 董在勤 关志宇柯学 颜洁

(1.江西中医药大学 南昌 330004；2.中国药科大学 南京 210000)

多潘立酮是一种苯丙咪唑类衍生物的合成药物，结构上与丙基甲酮苯基相似，一种多巴胺受体拮抗剂具有抗呕吐的作用[1]。主要作用于血脑屏障外的化学受体触发区，发挥胃动力效应。多潘立酮口服吸收较快, 无椎体外系不良反应, 且不易通过血脑屏障等,在临床上使用较广泛[2]。口服多潘立酮片生物利用度仅为13 %～17 %，服用常规剂量后血浆浓度较低为了提高其体内生物利用度，将其制备为多潘立酮的自乳化软胶囊。

自乳化释药系统是由药物、油相、非离子表面活性助及表面活性剂形成的溶液，此系统下略微搅拌在胃肠液介质中可以自动地形成粒子小于3 μm的乳剂。由于自乳化释药系统形成的乳剂粒子较小，有较大的油-水界面， 对那些由于溶出度小而难吸收的药物， 自乳化释药系统可提高药物的吸收程度和速度， 水不稳定药物的水解程度降低,提高其生物利用度。自乳化释药系统制备过程较简单, 性质较稳定，将溶液分装于软胶囊中， 剂量准确且服用方便, 为提高水不溶性药物的口服吸收提供一个新的有广阔前景的剂型型[3-5]。本实验采用HPLC-MS法作为检测方法，考察多潘立酮自乳化软胶囊在Beagle 犬体内药物动力学过程，并与多潘立酮片剂进行了比较，获得了对药物制剂进行体内评价的依据。

1 材料

1.1 仪器 Applied Biosystems (AB) Triple Quad 5500液质联用仪器，高速冷冻离心机(德国Sigma公司)，电子分析天平(十万分之一，万分之一，北京赛多利斯科学仪器有限公司)，数显恒温水浴锅(HH-4，上海江星仪器有限公司)，,精密增力电动搅拌器(JJ-1，常州国华电器有限公司)，胶体磨(TM-10，,天津鑫普机械制造有限公司)，软胶囊机(JLR-50，北京中天精蓝科技有限公司)，测厚规(上海川陆量具有限公司)，涡旋仪(VORTEX GENIUS3，,IKA仪器设备有限公司)，SZ-93自动双重纯水整流器(上海亚荣生化仪器厂)，超纯水仪(南京易普易达科技发展有限公司)，BF-2000氮气吹干仪(八方世纪公司)，KQ5200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，微量移液器(10～200μL，100～1000μL,Eppendorf)。

1.2 试药 多潘立酮粉末(批号：0146/15-16斯克里希纳制药有限公司(印度)，受试制剂：多潘立酮自乳化软胶囊(自制)；参比制剂：多潘立酮片剂(法国杨森制造，批号：6LV0641，规格：每片10mg)；对照品：多潘立酮对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100304-201103，含量：99.7%)；内标物：兰索拉唑(中国食品药品检定研究院，批号：100709-201304，含量：99.8%)；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 试验动物 犬的来源:福州振和实验动物技术开发优先公司、品种名称：比格犬(Beagle)，体重10Kg，雄性，6只。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件 色谱柱：色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(100mm×2.1mm，2.7μm)；流动相：甲醇+0.1%甲酸水(梯度洗脱程序：0 min，20∶80；1～2 min，80∶20；2.1～5 min，20∶80)；流速：0.3 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：1μL。

离子源：离子喷雾离子化(ESI)源；正离子方式检测；离子源电压(IS)：5500V；离子源温度(TEM)：550℃；气帘气(CUR)：35psi；雾化气(GS1)：45psi；辅助加热气(GS2)：45psi；扫描方式：多重反应监测(MRM)；定量离子对：多潘立酮426/175(DP80v，CE34ev)，兰索拉唑370/251.9(DP80v，CE16ev)扫描时间：250msec。

2.2 自乳化软胶囊的制备 按照处方量加入油相、乳化剂、助乳化剂和固化剂，60 ℃加热下，250r/min机械搅拌10min，使其充分溶解均匀。称取并加入药物，60 ℃加热下，250r/min机械搅拌10min，药物初步分散混合。趁热，胶体研磨5min，药物充分分散混匀。超声40min除气泡，静置放冷到室温，即得多潘立酮自乳化软胶囊。

2.3 溶液的配置 多潘立酮标准溶液 准确称取多潘立酮对照品10.00mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的贮备液。取该贮备液适量分别用甲醇稀释至浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 μg/mL，即得。

内标溶液 准确称取兰索拉唑对照品10.00 mg，置于10 mL容量瓶中加甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的贮备液，取该贮备液适量用甲醇稀释至浓度为250 ng/mL，即得。

2.4 药动学研究

2.4.1 给药方案和血样采集 本试验采用双交叉试验设计，将 6只受试比格犬随机分为两组，一组先服用受试制剂后服用参比制剂，另一组先服用参比制剂后服用受试制剂每次试验间隔 1 周。给药前禁食12h，口服1片/只， 置咽部用100mL 温水灌服给，,服药后2h开始饮水4h后开始进食。于用药前30min内采集空白血样, 口服后于20、40、60、90、120、150、180、210、240、300、360、720min在后肢静脉采血2mL。将采集到的血样置含肝素抗凝管中，离心(3500 r/min)10 min。(离心完后得到取出上清液血浆进行保存放去-80℃冰箱中保存)

2.4.2 血浆样品预处理 取500μL狗血浆样品先加入0.1mol/L氢氧化钠100μL，再加入20μL 的250ng/mL 内标兰索拉唑溶液和5mL乙醚加入到中，将该混合物涡旋混合3min，以4000r/min离心 10min， 将有机相转移到干净的管中并在40℃的氮气流下蒸发至干。 残留物用0.1mmol/L醋酸铵甲醇-醋酸氨(68∶32)重新配制成1mL，取1μL等份的上清液注入LC-MS系统。

2.4.3 方法的专属性 在本实验采用的分析条件和血浆处理方法,血浆中的内源性物质不干扰多潘立酮和内标兰索拉唑的定量分析， 取空白血浆(阴险对照)、空白血浆(含多潘立酮120ng/mL和兰索拉唑IS5ng/mL)(阳性对照)、多潘立酮口服后240min血浆样品按照血浆样品处理的方法见下图1，结果表明具有较高的专属性和灵敏度。

2.4.4 标准曲线 取空白血浆500 μL，依次加入多潘立酮标准系列溶液20μL，配成相当于血浆浓度为0.5，1.0，10.0，20.0，40.0，80.0，120.0，160.0ng/mL 血浆样品，按“血浆样品处理”项操作，取 1μL 等份的上清液，进行 HPLC-MS 分析，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，y=0.0566x+0.0762(r=0.9932)即为多潘立酮的标准曲线，结果见图2。

图1 典型色谱图

图2 多潘立酮标准曲线图

2.4.5 精密度 取空白血浆50.0μL，按“标准曲线的制备”项操作，制备多潘立酮低、中、高三个浓度的质量控制(QC)样品，每一浓度进行5样本分析，连续测定3批，计算QC样品的浓度，将QC样品的结果进行方差分析，根据QC样品求得本法的精密度，考察 批间精密度。结果见表1，由表可见，批内、批间间RSD均小于15%，RSD均在±15%范围内， 符合目前生物样品分析方法指导原则的要求。

2.4.6 萃取回收率 取空白血浆，按“标准曲线的制备和定量下限”项下的方法制备低、中、高三个浓度(分别为 1.0，40.0 和 120.0 ng/mL)的样品检测并记录浓度(A1)，同时取空白血浆500μL，萃取蛋白，吹干后加入多潘立酮和内标兰索拉唑混合溶液，配制成多潘立酮溶液浓度为(分别为 1.0,40.0 和 120.0 ng/mL)以及内标标溶液浓度的样品，检测并记录浓度(A2)。萃取回收率=(A1)/(A2)× 100%。(每一浓度进行 5样本分析， 测定的浓度平均值)，结果见表2低、中、高3种浓度的提取回收率分别为113%，94%，92%，表明此方法的萃取回收率符合测定要求。

2.4.7 基质效应考察 取空白血浆500μL，经血浆样品的处理方法后，去上清液加入多潘立酮和内标兰索拉唑混合溶液，配制成多潘立酮溶液浓度为(分别为 1.0，40.0 和 120.0 ng/mL)以及内标标溶液浓度的样品，进行法分析获得浓度(A2)。与另取上述3个的混合溶液直接进样获得峰面积，进行分析，得多潘立酮的浓度(B)。基质效应=(A2)/(B)× 100%，(每一浓度进行5样本分析，测定的浓度平均值)，结果见表2低、中、高3种浓度的基质效应分别为109，102%，96%，表明此方法的基质效应符合测定。

2.4.8 稳定性 依据“血浆样品处理”项方法制备稳定性 QC 样品，样品在室温条件下放置 12h、冷藏( 4℃) 条件下放置 24 h，20℃ 反复冻融 3 次，80℃保存 20d 的稳定性。结果表明，测定偏差均在± 15%以内，表明血浆样品在上述条件下稳定。

3 实验结果

3.1 药动学参数 采用DAS 2.1.1版药动学软件，分别计算市售片剂和自制软胶囊的药动学参数(统计矩模型)；采用SPSS 20.0版统计学软件，绘制平均血浆药物浓度-时间曲线图见图3，并对各药动学参数进行单因素方差分析见表3。

3.2 生物利用度对比评价 市售片剂和自制软胶囊的各药动学参数，单因素方差分析结果见表4。

自制软胶囊的平均AUC(0-t)是市售片剂的1.8倍，且有显著性差异；自制软胶囊的平均AUC(0-∞)是市售片剂的1.8倍，且有显著性差异 (P<0.05)。结果表明，与市售片剂对比，我们自制软胶囊能显著提高多潘立酮的生物利用度，达到制剂设计的目的。

4 讨论

在比格犬给药过程中，由于自制软胶囊直径较大，给药前应适量饮水，以润湿食管，否则直接给自制软胶囊比格犬会出现食道堵塞、呕吐现象。

表1 多潘立酮在血浆中精密度数据(n=6)

表2 多潘立酮在血浆中萃取回收率和基质效应(n=6)

图3 平均血浆药物浓度-时间曲线

药动学参数单位市售片剂自制软胶囊AUC(0-t)μg/(L·min)6262.75 ± 1439.65*11581.13 ± 2106.63*AUC(0-∞)μg/(L·min)6376.02 ± 1341.95*11849.71 ± 1884.22*Tmaxmin120 ± 2190 ± 21Cmaxμg/L41.80 ± 8.83*59.20 ± 9.66*T1/2zmin107 ± 5489 ± 12MRT(0-t)min196 ± 27171 ± 26MRT(0-∞)min212 ± 46182 ± 11

注：自制软胶囊与市售片剂相比，*P<0.05。

表4 市售片剂和自制软胶囊各药动学参数单因素方差分析

由于在血浆中多潘立酮药物含量浓度低，且血浆中有较多干扰杂质，故试验的关键是血浆样品预处理的过程，先加入一定量0.1mol/L NaOH 后用乙醚萃取，碱化后萃取的方法既提高了样品的处理速度， 又避免了干扰。本研究建立了HPLC-MS方

法，测定血浆中多潘立酮的浓度，不仅灵敏度高、选择性好而且简单快速, 每个样品的检测时间仅为5.0 min，适合大批血浆样品的处理。在分析结果表明，多潘立酮在0.5～160μg/L 内，多潘立酮峰面积与内标峰面积的比值与多潘立酮浓度之间线性良好。分析方法的回收率、精密度符合药物动力学研究的要求。

首先，自乳化软胶囊中药物以微小的液滴形式存在，使药物的表面积增大，可产生脂解已经形成胶束，增加药物吸收，提高其口服药物生物利用度。其次，增加自乳化软胶囊使药物溶出速率和溶解度，处方中药物将以分子的形式完全溶解，对于自乳化软胶囊还避免水难溶药物这一限速步骤，提高其口服药物生物利用度。再次，自乳化软胶囊增加胃肠道上皮细胞对药物的穿透性，促进药物吸收，提高其生物利用度，最后，自乳化软胶囊克服了首过效应，由淋巴系统吸收，避免被胃肠道内酶将药物水解，同时某些大分子被胃肠道上皮细胞拦截，提高药物的生物利用度。从体内数据可以看出，自制软胶囊的平均AUC(0-∞)是市售片剂的1.8倍，且通过单因素方差分析有显著性差异, 说明将多潘立酮制成自乳化软胶囊后，其生物利用度有所提高。