高效液相色谱法测定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮

耿振 姜延国 尹晶

（辽宁省丹东市卫生健康服务中心 辽宁丹东 118000）

1 前言

玉米赤霉烯酮的检验方法包括免疫亲和-液相色谱法、薄层层析法和酶联免疫（ELISA）法[1]等，其中，免疫亲和-液相色谱法最普遍，其原理是：目标物质经免疫活性物质特异性分离后，以高效液相色谱-荧光检测器或高效液相色谱-质谱检测。玉米赤霉烯酮不仅危害玉米，还大面积危害大麦、小麦等谷类作物，且还会由于储存条件不善，污染其他作物制品[2]。玉米赤霉烯酮会导致一些拟/抗雌激素效应，损伤DNA，诱发肿瘤，也会对血液和免疫毒性方面造成影响[3]。

本文采用免疫亲和-高效液相色谱-荧光检测法，检测玉米、小麦等谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的含量。

2 材料和方法

2.1 仪器与试剂

LC-20AT 高效液相色谱仪配荧光检测器（日本岛津公司）；Milli-Q 纯水系统（美国Millipore 公司）；AUW120电子天平（日本岛津公司）；玉米赤霉烯酮标准溶液：ZearaStar（ROMER 国际贸易有限公司）密度ρ=100.4 μg/mL；玉米赤霉烯酮免疫亲和柱：ZEARALE NONE IN ACETONITRILE（ROMER 国际贸易有限公司）；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）（山东禹王实业有限公司化工分公司）；本实验用水均为纯水（电阻率为18.25 MΩ·cm）。

磷酸盐（PBS）缓冲液的配制：称取8.000 g 氯化钠、1.200 g 磷酸氢二钠、0.200 g 磷酸二氢钾、0.200 g氯化钾，用990 mL 纯水溶解上述试剂，然后用浓盐酸调节pH 至7.0，再用水稀释至1 L。

2.2 方法

2.2.1 样品前处理方法

样品经粉碎后，准确称取（40.000±0.010）g 于具塞三角瓶中，加入100 mL 乙腈∶去离子水84∶16 提取，振荡1 h，过滤后得提取液。将3.00 mL 提取液和25.00 mL PBS 缓冲液均匀混合，后通过免疫亲和柱，控制流速为1～3 mL/min，依次用10 mL PBS 缓冲液和10 mL 去离子水分别淋洗免疫亲和柱，再用3×0.50 mL 甲醇洗脱免疫亲和柱收集洗脱液于试管中。将收集的洗脱液于60℃氮吹近干后，用1.00 mL 混合溶液（乙腈∶水∶甲醇=46∶46∶8）复溶，待漩涡混合均匀后，复溶液过0.45 μm 滤膜上机检测。

2.2.2 仪器条件

色谱柱：ThermoFisher BDS Hypersil C18 色谱柱，150 mm×4.6 mm（内径），粒度5 μm；流动相：乙腈∶水∶甲醇=46∶46∶8；流速：1.000 mL/min；检测波长：激发波长274 nm，发射波长440 nm；柱温：30℃；进样量：100 μL。保留时间定性，外标法定量。

3 结果

本检测方法的各项指标测定结果详见表1。

表1 检测方法各项指标及其结果

3.1 精密度与准确度结果分析

选取50 μg/L 的标准使用液，做了7 次重复测定，考查荧光检测器的精密度。结果表明，7 次重复测量的RSD 为0.19%，说明荧光检测器具备较高的精密度。

分别称取40 g 样品（精确至0.001 g）4 份，分别添加2 μg 和3 μg 玉米赤霉烯酮标准品，添加回收率均为91.3%～99.5%，说明免疫亲和-高效液相色谱法准确度较高。

3.2 方法标准曲线线性范围及检出限结果分析

选取的标准溶液浓度系列1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L 和100 μg/L，具有较宽的线性范围；标准曲线的相关系数为0.999 9，大于相关系数0.999 0的要求；由标准曲线的斜率可见，该方法具有较高的灵敏度；3 倍信噪比的检出限为0.8 μg/kg，10 倍信噪比的定量限为2.7 μg/kg。

4 结论

本文建立了谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的免疫亲和-高效液相色谱检测方法。该方法标准曲线线性较好，检测浓度范围较宽，具有较高的精密度和准确度，检出限较低，适应性较强，各项检测指标均符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[4]中痕量污染物检测的要求。免疫亲和-高效液相色谱法的核心是免疫活性物质可以和靶标物质特异性结合，经过甲醇洗脱后，靶标物质基本上可以全部被保留和洗脱下来。该检测方法的回收率好、精密度高，适用于谷物及其制品中玉米霉烯酮的检测。