HPLC法同时测定红花如意丸中3种有效成分

韩小月 王俊芳 李菲 曹秋娥

（1.云南华测检测认证有限公司 云南昆明 650000；2.云南大学 化学科学与工程学院）

1 前言

红花如意丸作为传统藏药，由红花、西红花、鬼臼（桃儿七）、诃子、藏茜草等20 多味药材组成，具有活血化瘀、祛风镇痛等功能，可用于治疗慢性盆腔疼痛、下肢关节疼痛、筋骨肿胀、麻木、小腹冷痛及寒湿性痹症等[1-3]。羟基红花黄色素A（HSYA）是检验红花品质的指标性成分[4]，具有扩张冠状动脉、保护心肌、降血压、抗氧化、免疫抑制等多种功能[5]；西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ则是西红花质量控制的指标性成分，具有抗血小板聚集、保护血管、改善心肌缺血和调血脂等功效。因此，分析测定红花如意丸中的羟基红花黄色素A、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ具有重要意义。目前，已有不少文献对一些药材或制剂中的羟基红花黄色素A 或西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的分析检测进行了研究，但对这3 种成分的同时分析检测很少。本文采用高效液相色谱（HPLC）法，研究了红花如意丸中羟基红花黄色素A、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ这3 种成分的同时分析检测，该法简单、快速、准确，对红花如意丸的质量控制有一定的参考价值。

2 仪器与材料

Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；Agilent eclipse XDB-C18 色谱柱，4.6 mm×250 mm，5 μm（美国安捷伦科技公司）；优普特实验室超纯水器（UPT-Ⅰ-20T，成都超纯科技有限公司）；SG7200HE 超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）。对照品羟基红花黄色素A、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ（中国药品生物制品鉴定所），规格均为98%；HPLC 分析用流动相甲醇为色谱纯（美国Fisher 公司）；磷酸及其他实验用品甲醇均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；红花如意丸（甘南佛阁藏药有限公司）。

3 方法与结果

3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent eclipse XDB-C18（4.6mm×250mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.3%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，45%～100%A）；流速：1.0 mL／min；柱温：30℃；检测波长：403 nm；进样量：5 μL。

3.2 对照品溶液的配制

对照品羟基红花黄色素A（0.60 mg/mL）、西红花苷Ⅰ（0.94 mg/mL）和西红花苷Ⅱ（0.88 mg/mL）的单标储备液由甲醇配制，4℃冰箱储存。对照品羟基红花黄色素A（120 μg/mL）、西红花苷Ⅰ（188 μg/mL）和西红花苷Ⅱ（176 μg/mL）的混合溶液由各对照品的单标储备液用甲醇配合。

3.3 供试品溶液的配制

取20 粒红花如意丸，研至细粉，精密称取粉末约0.25 g，置棕色瓶中，加入25 mL 甲醇，超声处理1 h，过滤，减压蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至10 mL，使用前用0.45 μm 微孔滤膜滤过。

3.4 方法学考察

3.4.1 线性关系考察

配制不同浓度的混合对照品溶液，精密吸取混合对照品溶液5 μL，在“3.1”项色谱条件下分别进行测定。以各组分浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，拟合回归方程，结果详见表1。

3.4.2 精密度考察

精密吸取同一浓度下的混合对照品溶液5 μL，在“3.1”项色谱条件下连续进样5 次，测定羟基红花黄色素A、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的峰面积，计算得到各组分峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.08%、1.52%和0.89%，表明仪器的精密度良好。

表1 各组分的工作曲线

3.4.3 重复性考察

分别精密称取红花如意丸粉末5 份，每份约0.25 g，按“3.3”项下方法制备成供试品溶液，依次进样5 μL，测定羟基红花黄色素A、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的含量，计算得到各组分含量的相对标准偏差（RSD）分别为0.16%、0.74%和1.45%，表明方法的重复性良好。

3.4.4 加标回收率实验

精密称取3 份已知含量的红花如意丸，每份约0.25 g，然后按羟基红花黄色素A、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ在样品中的含量的150%、100%和50%加入这3 种组分的标准品溶液，再按“3.3”项下方法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件进行分析，计算加标回收率。结果表明，羟基红花黄色素A、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的平均加标回收率依次为100%、98.9%和103.6%，相对标准偏差依次为1.43%、0.14%和0.79%。

3.5 样品测定

准确称取红花如意丸3 份，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件进行分析，然后用标准加入法对色谱图中的组分进行定性识别，用外标工作曲线法对各组分进行定量分析，计算得到羟基红花黄色素A、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ成分的含量分别为326.22 μg/g、682.13 μg/g 和97.87 μg/g。

3.6 色谱条件的优化

实验首先尝试了以甲醇-水、乙腈-水为流动相进行等度洗脱，结果发现，不管怎样改变甲醇-水或乙腈-水的组成比，3 组分的分离情况和峰型都不够理想。因此，实验又进一步尝试了以甲醇-水、甲醇-不同浓度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）的磷酸水溶液和甲醇-不同浓度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）的醋酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，结果发现，以甲醇（A）-0.3%磷酸水溶液（B）进行梯度洗脱（0～20 min，45%～100%A）效果最好。实验还对比了柱温为30℃和40℃时的分离情况，最终选择了效果更佳的30℃为柱温。在选定的色谱条件下，混合对照品溶液和红花如意丸样品溶液的色谱图详见图1。

图1 混合对照溶液液相色谱图（a）和红花如意丸样品液相色谱图（b）

由图1 可知，羟基红花黄色素A、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ不仅彼此之间在9 min 内得到了有效分离，而且还与样品红花如意丸中的其他共存组分之间得到了有效分离。

4 结语

本实验建立了一个可以同时分离测定红花如意丸药品中的羟基红花黄色素A、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的高效液相色谱新方法。结果表明，在本实验选定条件下，羟基红花黄色素A、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ这3 种成分在9 min 内实现了基线分离与有效检测。测试样品中，各目标成分的加标回收率为98.9%～103.6%，相对标准偏差小于1.5%，说明该方法具有简单、快速、准确度高和重现性好的优势。