农药残留免疫分析技术研究进展

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(1.黑龙江大学,农业微生物技术教育部工程研究中心,黑龙江哈尔滨 150500;2.黑龙江大学生命科学学院,黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室,黑龙江哈尔滨 150080)

现代农业和粮食生产中需要使用农药等化学物质,但这些化学物质的不合理或过度使用对人类和生物体造成严重危害,引起严重的环境和食品安全问题[1-2]。目前有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类农药在市场上应用广泛,特别是有机磷类杀虫剂仍在生产上起主导作用。近年来,在各种基质中农药的检测取得了许多进展[3],如高效液相色谱(HPLC)[4-5]、气相色谱(GC)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)[6-9]、气相色谱-质谱联用(GC-MS)[10-11]等。这些方法精密度与灵敏度很高,但对检测人员技术要求高,设备昂贵,前处理过程复杂费时,不适用于现场快速检测。免疫分析方法样品前处理简单、结果呈现快速、现场携带方便,受到越来越多的关注。本文将对免疫分析技术在农药残留检测中的应用及研究进展进行综述,以期为农药残留快速检测工作提供一定的理论基础和依据。

1 标记免疫分析技术

标记免疫分析一般是将酶、荧光素等标记物对抗体或抗原进行标记,保持抗体或抗原的活性的同时也不影响标记物的活性,当相应抗体或抗原发生反应后,可以直接测定复合物中的标记物而对目标物质进行定量分析。标记物的信号放大作用可以提高免疫分析技术的敏感性[12]。检测领域的免疫分析标记方法主要有酶标记、纳米金标记、免疫荧光标记等。

1.1 酶联免疫吸附分析

酶联免疫吸附分析(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是将已知抗原或抗体结合到如聚苯乙烯等固相载体表面,利用抗原抗体结合的特异性,使酶标记的抗原抗体在固相表面进行反应。

图1 酶联免疫分析检测技术分类Fig.1 Classification of ELISA techniques

检测农药酶联免疫方法多数为竞争ELISA和间接竞争ELISA(图2)。

图2 竞争(a)和间接竞争ELISA(b)原理图Fig.2 Competitive(a)and indirect competition ELISA schematic

采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验,大大提高了ELISA的特异性,加上电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用,使ELISA更为简便实用和标准化,从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。何方洋等[13]针对快速检测蔬菜、茶叶中呋喃丹残留通过合成呋喃丹半抗原,并与载体蛋白偶联合成人工抗原,制备其单克隆抗体,建立的酶联免疫检测方法对蔬菜、茶叶样本的检测限分别为10、5 μg/kg,加标回收率为79.2%～102.7%。Zhu等[14]对比了三种ELISA形式(抗原包被、抗体包被和二抗包被),从三种ELISA形式生成的标准曲线可以看出,抗体包被形式具有最好的标准曲线,抗体包被和二抗包被形式之间的灵敏度差异并不显着,但二抗包被形式变异系数最小;基于标准曲线的灵敏度和可重复性考虑,选择二抗包被形式对于加标样品进行检测,检出限为3.44 ng/mL,回收率为85.24～106.9%。Watanabe等[15]针对土壤中三种水溶性(植物可利用)新烟碱类杀虫剂(呋虫胺,噻虫胺和吡虫啉)开发了一种简单、快速的基于试剂盒ELISA的定量检测方法,可用水直接提取待测物,该方法测定的IC50值分别为:呋虫胺3 ng/mL、噻虫胺1.8 ng/mL、吡虫啉2.2 ng/mL,但与结构相关的新烟碱类似物发生交叉反应,可能产生假阳性。

通常一种抗体只能检测单种农药,难以满足一次检测同时检出多种农药的需求[16]。为了解决这一问题,Xu等[17]通过广谱特异性直接竞争ELISA快速筛选出多个阳性样品,结合高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)对阳性样品进行定性和定量,基于辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体和固相萃取的直接竞争ELISA可同时分析42个样品,同时进行12个有机磷农药的检测,在40 min内完成检测,检测限为20 μg/L,回收率为70.0%～133.3%,具有良好的准确性和重现性。文孟棠等[18]针对拟除虫菊酯类农药制备了广谱性抗体,建立了用于蔬菜中拟除虫菊酯类农药的检测的半定量ELISA 免疫检测方法,以间苯氧基苯甲酸为半抗原,分别用活性酯法、混合酸酐法和6-氨基己酸法三种方法偶联OVA制备出的3种包被抗原;该方法可在45 min内同时完成多种农药的检测,IC50为6.30 μg/ml。该方法具备对大量样品快速初筛的应用潜力,但只适用于半定量,其结果的准确性和重现性有待提高。

1.2 纳米金标记

胶体金侧向流免疫层析试纸条是纳米金标记应用最广的手段之一,是一种低成本、易操作、快速的测定和筛选的用户友好型测量工具[19]。碱性条件下,带负电荷的胶体金与带正电荷基团的蛋白质分子通过静电力的作用而牢固地结合。以硝酸纤维素膜为载体,滴加在膜条样品垫上的待测样品通过毛细管的作用慢慢向另一端渗移,通过抗原抗体结合,并利用胶体金呈现颜色反应,检测抗原/抗体。农药属于小分子物质,基于试纸条检测时多采用竞争法,如图3所示。

图3 胶体金侧向流免疫层析试纸条竞争法原理图Fig.3 Competition method schematic of colloidal goldlateral flow immunochromatographic test strip

1.2.1 单一物质检测试纸条 为了快速简便地检测出食品中的农药残留,王菡等[20]制备出抗广谱有机磷农药的组特异性单克隆抗体,鞣酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金标记单克隆抗体,组装胶体金免疫层析试纸条,建立了对有机磷农药的快速检测方法。该方法对毒死蜱检测限为4 μg/mL,检测时间仅需5 min。3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)是合成拟除虫菊酯的一般代谢产物,可以用作拟除虫菊酯类农药残留物的通用生物标志物,Liu等[21]通过使用PBA-BSA作为免疫原制备针对3-PBA的单克隆抗体,建立基于胶体金的侧向流动免疫测定试纸条。在不需要任何样品预处理情况下10 min可完成检测,检测限为1 μg/mL。这种侧向流动免疫测定可用于监测环境样品中3-PBA或拟除虫菊酯残留物。

表1 酶联免疫吸附分析技术与胶体金侧向流免疫层析技术在农药残留快速检测中的应用Table 1 Application of enzyme-linked immunosorbent assay and colloidal gold lateralflow immunochromatography in rapid detection of pesticide residues

注:/代表文献中未提及。1.2.2 多重免疫检测试纸条 在检测单个待测物的基础上,Xu等[22]将纳米胶体金标记的吡虫啉和噻虫嗪单克隆抗体固定于结合垫,吡虫啉-BSA、噻虫嗪-BSA和山羊抗小鼠IgG的结合物分别用作两条测试线和控制线,可在一个条带上同时筛选农产品中吡虫啉和噻虫嗪。Shu等[19]制备了能够同时识别甲基对硫磷和吡虫啉的新型双功能抗体,开发了基于时间分辨化学发光策略的多重免疫色谱测试条,用于定量检测农药残留。该方法将辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶分别标记甲基对硫磷和吡虫啉的半抗原,由于两种酶不同的动力学特征,可在2.5和300 s收集甲基对硫磷和吡虫啉检测的信号。该方法可以在单个测试线上实现多重免疫测定。

1.2.3 试纸条结合光谱 ICA技术虽然可实现农药的现场快速检测,但该方法是半定量的并且灵敏度低。因此,开发高灵敏度检测新型ICA产品是该技术发展方向。表面增强拉曼光谱(Saurface enhancement of Raman scattering,SERS)由于其超灵敏特性而在生物检测中开始兴起。SERS可以将吸附在Ag或Au金属纳米结构上,目标物拉曼信号增强多达6到14个数量级,甚至可以检测单个分子[23-24]。ICA技术可以通过NC膜和胶体金为纽带与SERS技术有机结合,实现对目标物高灵敏检测。Li等[25]在试纸条的基础上开发了基于SERS的免疫色谱测定方法,可用于检测两种拟除虫菊酯农药(氯氰菊酯和氰戊菊酯)。在抗体缀合的胶体金颗粒上添加了拉曼标记分子,通过在试纸条上固定检测两种农药的两条测试线,完成了同时双重检测,检测测试线上的SERS信号对待测物进行定量分析。灵敏度比使用相同间接竞争性免疫测定方法的ELISA和ICA方法高3～4倍。该方法将ICA与SERS有机结合,在保留传统ICA简便、快捷等优点的基础上,实现了对待测物的定量检测,而且获得了极低的检出限。

1.2.4 ELISA与试纸条对比 酶联免疫吸附分析技术与胶体金侧向流免疫层析技术因其方便快速、高特异性、应用范围广等有点得到广泛应用。如表1所示,胶体金侧向流免疫层析技术与酶联免疫吸附分析技术相比所需的检测时间更短,成本低,标记物稳定,适合大批量的初筛检查。胶体金本身为红色,无需加入发色试剂、酶标的致癌性底物及终止液。而电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用,使ELISA更为标准化。

1.2.5 纳米金结合生物条形码技术 随着纳米技术领域快速发展,生物条形码技术已成为新的诊断工具,并逐渐被用于蛋白质,核酸靶标和小分子化合物的超灵敏检测[26]。生物条形码技术是利用磁场作用使“金纳米颗粒-目标物-磁纳米颗粒”复合物聚合,之后释放金纳米颗粒表面的寡聚核苷酸以达到信号放大的目的,从而实现对目标物的检测,应用于食品安全和传感检测领域[27]。Du等[28]提出了一种新型免疫测定法检测三唑磷。该方法基于生物条形码扩增竞争性免疫分析,并以微孔板方法量化条形码链进行目标物的定量分析。利用两种探针检测三唑磷,分别是:针对三唑磷的单克隆抗体和数百个硫醇化单链寡核苷酸条形码双标记的AuNPs;人工抗原标记的磁性微粒。标记在磁性微粒上表面的抗原与三唑磷竞争标记在AuNPs表面的单克隆抗体。用磁选法去除多余的农药和探针,通过添加二硫苏息醇释放条形码。随后,半互补生物素化DNA和单标记AuNP探针与杂交条形码以三明治形式捆绑,通过链霉抗生物素蛋白-生物素将杂交复合物固定在微孔板上。最后,通过微孔板读数器记录金纳米颗粒的银增强信号,检出限为1.96×10-2ng/mL。在这种方法中,少量的目标已经转换成大量条形码链而是信号显著放大,灵敏度高,特异性强。此外,在没有专用仪器的情况下可通过微孔板读数器检测结果。

1.3 免疫荧光分析技术

免疫荧光分析技术是将荧光物质标记到抗原或抗体上,与相应抗原或抗体结合后通过检测荧光强度确定待测物浓度的一种检测方法。荧光具有独特的发光特性,可大大减少背景信号并显着提高灵敏度[29]。Zhang等[30]为了提高测定准确度,使用具有时间分辨荧光特征的铕颗粒来降低背景信号,将呋喃丹特异性抗体与铕颗粒结合固定于测试线(T),将小鼠IgG与铕颗粒结合固定于对照线(C)。建立呋喃丹浓度与T/C比之间的定量关系以确定分析物浓度。LOD为0.04～0.76 mg/L,农产品中呋喃丹的加标回收率为81%～103%,结果与标准HPLC方法一致。Zhang等[31]开发并验证了使用多重修饰的金纳米颗粒和荧光扩增进行三唑磷检测。用单克隆抗体和6-羧基荧光素标记的单链硫醇-寡核苷酸修饰通过AuNP淬灭6-羧基荧光素的荧光。将OVA连接的半抗原包被在微孔板的底部与样品中的三唑磷竞争结合AuNP探针上的抗体,荧光强度与分析物浓度成反比。本方法成功应用于水、蔬菜、水果和谷物中的三唑磷检测,IC50可达0.25 mg/L,且工作范围广。该研究中的竞争性荧光生物条形码免疫测定提供了小分子检测模型。

大多数有机荧光分子都受到聚集引起的猝灭的影响,其在高浓度或固态下的荧光效率大大降低。Peng等[32]发现了一组具有聚集诱导发射(AIE)特征的荧光分子。与常规荧光团相比,这种分子在聚集状态下表现出强荧光。其独特的性能为AIE探针提供了显着的优势,例如较低的背景和较高的光稳定性[33]。四苯乙烯(TPE)是一种AIE代表性分子,Cai等[29]合成了TPE衍生物,根据其AIE效应表征其结构并敏感地检测pH。在乙酰胆碱酯酶存在下,乙酰硫代胆碱碘化物可以水解产生乙酸,改变溶液的pH,从而影响荧光。因有机磷可以抑制乙酰胆碱酯酶的酶促能力,从而可以间接实现有机磷的荧光检测,检出限为0.008 mg/L,为pH敏感荧光探针的设计提供了新的方法。

量子点作为一种新型的荧光标记材料,因其具有较好的荧光特性,广泛应用于发光生物探针领域量,以用来提高检测灵敏度[34]。胡华军等[35]将抗克伦特罗多克隆抗体连接到已合成的CdTe/ZnSe核壳量子点上,将该偶联物作为指示克伦特罗分子的荧光标记物,制备出检测克伦特罗分子的免疫层析试纸条,其最低检测量可达1 μg/L。定量检测的量子点试纸条灵敏度比胶体金免疫层析试纸条要高,逐渐成为免疫层析分析技术研究的热点[36]。

2 免疫传感器

免疫传感器是基于转换器表面上的抗体和抗原之间的相互作用的生物传感器。抗体或抗原都可以是固定在换能器上以检测抗原或抗体的物种[37]。生物传感器由于其灵敏高、选择性好、分析速度快、成本低等优点在农残检测领域发展迅速[38]。

2.1 电化学免疫传感器

电化学免疫传感器探索在电化学转换器上产生的电信号的测量。韩恩等[39]开发了一种免标记电化学免疫传感器用于多种蔬菜样品中呋喃丹的快速、高灵敏检测。呋喃丹分子通过特异性的免疫反应在抗体功能化电极表面生成免疫复合物,阻碍了电化学探针在电极表面的电子传递,减小了该免疫传感器的电流响应。通过电流响应的变化和农药分子浓度的关系可以实现被测物的检测。在优化的试验条件下,该免疫传感器对呋喃丹农药表现出了较为宽广的浓度检测范围(1～105μg/L)和较低的检测下限(1 μg/L)。Valera等[40]制备了百草枯特异性抗体,利用带有半导体纳米晶和抗原生物功能化磁珠的抗体,使用石墨复合电极进行电化学测量,用于百草枯的检测。免疫化学反应后,半导体纳米晶被溶解,释放的金属离子在电极上被还原,读取电荷信号。由于半导体纳米晶对库伦信号的放大效应,使其具有很高的检测能力。Mehta等[41]基于功能化石墨烯量子点的丝网印刷电化学免疫传感器,用于检测对硫磷。该免疫传感器对对硫磷的动态线性响应为0.01～106ng/L,检测限为46 pg/L。在保持极低检出限的基础上,石墨烯量子点的应用提高了传感器的稳定性,响应再现性和可再现性。Zon等[42]将非竞争性免疫检测和磁电化学免疫传感器检测相结合,开发了新的噬菌体抗免疫复合物电化学免疫传感器,用于定量检测阿特拉津。该方法检出限为0.2 pg/mL,比常规竞争ELISA中相同抗体得到的检出限要好200倍。Talan等[43]基于胶体金技术研制了新型氟掺杂氧化锡电极(FTO)纳米传感器可实现毒死蜱农药的快速灵敏检测。将金纳米粒子固定在FTO表面以固定抗毒死蜱抗体,同时金纳米粒子与FTO的协同作用可以使Ag-抗体相互作用的信号放大。AuNPs提供高电导率和电阻率,从而提高免疫测定的灵敏度,同时抗体提高了传感器的特异性。该传感器的线性范围为1 fmol/L至1 μmol/L,LOD高达10 fmol/L。金纳米粒子和FTO等智能元件的耦合提供了更好的传感平台,从而显着改善了农药的检测范围。

而与水溶液相比,许多农药更易溶于有机溶剂或溶剂混合物,为了解决这一问题,Martini等[44]开发了用于有机溶剂混合物的新型免疫传感器用于分析农药,可在疏水基质中检查痕量的农药。使用Clark电极作为转导物,过氧化物酶作为标记物。竞争过程在氯仿-己烷50%(V/V)混合物中进行,而随后的酶促最终测量在癸烷中进行并使用叔丁基过氧化氢作为酶促反应的底物。通常在橄榄油存在下获得约10 nmol/L至5.0 μmol/L的线性响应。

2.2 表面等离子共振传感器

在过去的几十年中,表面等离子共振(Surface plasmon resonance,SPR)生物传感器因其可实时、原位和动态观测各种生物分子而受到越来越多的关注[45]。SPR方法基于与样品中分析物分子结合相关的折射率变化的光学测量,以识别固定在SPR传感器上的分子[46]。该技术已被广泛用于研究DNA-蛋白质、抗体-微生物、抗体-抗原等之间的相互作用。与ELISA方法相比,SPR方法操作简单,检测快速,样品消耗低[47]。Gouzy等[48]将抗异丙隆-鼠单克隆抗体固定在SPR芯片表面,应用竞争法对异丙隆进行检测,检出限为0.1 μg/L。该实验中抗鼠(k链)单克隆抗体在保持抗体活性的同时可循环再生120次。宋洋等[49]使用SPR传感器检测亚胺硫磷,检测时间为30 min,最低检出限为0.1 μg/L。SPR反应芯片在3 d内可反复检测30次,有效降低了检测成本。Guo等[50]使用直接SPR生物传感器进行三唑磷痕量检测的非竞争性免疫测定。将两种抗三唑磷单克隆抗体固定在传感器芯片上,并通过基于SPR的动力学分析进行表征。具有相对慢的解离速率的单克隆抗体用于三唑磷的直接免疫传感。该方法可用于测定加标环境水和农产品中的三唑磷,以及未知的现实样品(包括大白菜,黄瓜和苹果),检出限为0.096 ng/mL。与酶联免疫方法相比,SPR方法在检测限、精确度、灵敏度等方面有着一定优势,但对于单残留样品的检测,在时间上不具有明显优势,更适合于高通量、多残留的检测。

2.3 新型免疫传感器

2.3.1 光纤免疫传感器 近年来,光纤免疫传感器由于具有很高的灵敏度,成本效益和实时快速检测等优势而受到广泛关注,Tang等[51]通过使用基于间接竞争免疫测定的光纤免疫传感器,开发了一种快速灵敏的邻苯二甲酸酯(PAEs)检测方法。该传感器通过光纤表面与涂层抗原共价结合构建,并通过雪崩光电二极管检测PAEs对涂层抗原与荧光标记抗体之间免疫反应的抑制信号。8种PAEs的检测限范围为19～51 ng/L,加标平均回收率为61.5%～106.7%,所得结果与气相色谱-质谱法得到的结果一致。该光纤免疫传感器具有良好的再生性能,重现性、稳定性和较宽的线性范围,灵敏度高,检测PAEs检测时间短的特点,已成功应用于温室土壤中多种PAEs的测定。

2.3.2 无标记免疫传感器 在无标记方法中,固定化受体优先结合靶分子,并直接测量换能器表面上产生的物理性质变化。与依赖性标记免疫检测方法相比,这种无标记的直接检测方法具有简单、成本低、响应实时等优点,是免疫传感器的一个重要优势[52]。

2.3.2.1 晶体管免疫传感器 Belkhamssa等[53]针对于快速测定阿特拉津建立了一种无标记免疫传感器,该免疫传感器利用单壁碳纳米管(SWCNT)充当导体通道,结合场效应晶体管(FET)构成碳纳米管场效应晶体管(CNTFET)。免疫反应的原理在于将阿特拉津特异性抗体直接吸附到SWCNT网络上,CNTFET可用作检测阿特拉津的有用的无标记平台。在最佳条件下,检测限为0.001 ng/mL。加标平均回收率为87.3%～108.0%。SWCNT是一维纳米结构,由于其表面存在的碳原子显示出高电子转移反应,因此,巨大的表面积以及不同分子功能化的可能性使其成为理想的传感器,用于特异性检测各种分析物甚至病毒。

2.3.2.2 微悬臂梁免疫传感器 Dai等[54]报道了一种基于微悬臂梁的免疫传感器可用于检测呋喃丹,且无需用荧光或放射性分子标记。该工作的分析原理基于抗体-抗原复合物的形成,并且它可以降低电极和电活性探针分子之间的电子转移速率,导致电子转移电阻的进一步增加。测量免疫前后的电子转移抗性的差异以实现靶分析物的感测。通过使用单克隆抗体将呋喃丹作为受体分子,定量检测呋喃丹,检出限为0.1 ng/mL。但其体积大或使用位置敏感激光器的复杂检测方法,使其不易配置,不易快速检测。

2.3.2.3 谐振器免疫传感器 为了实现快速灵敏的检测,Wang等[52]开发一种基于薄膜体声谐振器的高灵敏度免标记免疫传感器,将人工抗原固定在谐振器的传感表面上,采用竞争形式进行免疫测定。通过测量谐振器频率变化实时观察竞争性免疫反应,获得的对硫磷的超低检测限低至0.08 μg/L。所提出的免疫传感器是一种快速方便的检测方法,具有与气相色谱相当的高精度。

3 仿生免疫

单克隆和多克隆抗体稳定性差而且寿命短。科学家们设计并合成了人工抗体代替天然抗体,以试图克服这些问题。通过分子印迹技术来获得人工抗体的方法引起了人们很大的关注。近年来已经报道了许多仿生酶联免疫吸附测定方法,这些方法提高了识别能力并降低了成本[55]。Li等[56]使用聚合物材料作为仿生抗体,开发了一种仿生免疫测定-毛细管电泳方法,检出限为0.16 mg/L;将仿生免疫分析技术与毛细管电泳结合,可以在利用仿生免疫分析特异性的同时,具备毛细管电泳高分离效率的特点,以此提高仿生免疫分析的灵敏度和准确性。

分子印迹聚合物是一种含特异性识别位点的高分子材料,因为它的高稳定性、低成本、制备简单和可重复利用等特点,常被作为仿生抗体应用于免疫分析[57]。由于结构可预测性,识别特异性和应用普遍性的独特特征,分子印迹技术已广泛应用于各个领域[58]。Liu等[55]建立了一种基于分子印迹聚合物的直接竞争仿生免疫吸附测定方法,用于韭菜和黄瓜样品中敌百虫残留的测定。使用CdSe/ZnS量子点标记作为标记。在96孔板表面合成亲水印迹薄膜,并通过傅里叶变换红外光谱和热重分析进行表征。通过该方法提取并测定加入敌百虫的菠菜和油菜样品回收率为83.6～91.1%,检出限为0.1 mg/kg。该方法中,代替抗体的印迹膜是稳定的,但识别能力明显低于生物抗体。

上述两种仿生免疫方法检测的结果与气相色谱法都呈现良好的相关性。

4 总结与展望

免疫分析检测技术是基于抗原抗体特异性结合建立的,常用的ELISA具有较好的准确性和重复性,但检测过程中仍需大量的孵育时间;胶体金侧向流免疫层析技术操作简单,无需专业人员操作,检测结果可快速呈现,不需要大型仪器,携带方便适用于现场检测。但该方法仍存在一定的局限性,如灵敏度和精确度普遍较低,大多用于半定量及定性检测。相对来说,结合光谱定量可在实现快速检测的同时大大提高其精确度和灵敏度。而随着分子印迹技术、基因重组技术、表面等离子共振技术的快速发展,与之相结合来建立高精确度、高灵敏度的免疫检测方法,实现农药多残留的检测成为免疫分析检测技术新的发展方向。因此,在保留免疫分析技术自身优势的基础上不断进行完善,会使其在农药残留的快速检测方面发挥越来越重要的作用。