透明质酸-明胶复合膜的制备及理化性质研究

(绥化学院食品与制药工程学院,黑龙江绥化 15206)

近年来,生物基可食用包装材料因其具有生物可降解性、生物相容性、抗氧化、抑菌、除氧和除水等多种功效,广泛用于食品包装及食品表面涂膜,提高了食品的感官性状及贮藏期限,成为研究热点[1-3]。

生物基可食用包装材料的主要成分包括多糖、蛋白质、脂类等,明胶因其具有良好的生物相容性,具有防止食品腐败变质、氧化的作用,是常用的生物基食品包装膜材料之一[4-5]。为提高包装材料的耐水性、机械和阻隔等性能,通常可通过两种或两种以上成分利用共价键或非共价键形成交联网络结构,利用转谷氨酰胺酶催化交联明胶-壳聚糖复合膜,对新鲜葡萄具有良好的保鲜效果[6];刘莉莉[7]将明胶与壳聚糖以9∶1比例复配制得复合膜,其阻氧性能较佳,可作为方便面调料包的包装材料。由于壳聚糖存在溶解性差、对pH的依赖性强和机械性能不佳等缺点,因此,开发新型明胶基高分子膜材料具有重要的研究价值。

透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是动物细胞基质的主要成分,具有保水性、抗菌性、清除自由基、成膜性、促进伤口愈合、生物相容性等重要生理功能[8-9]。2008年中国卫生部公布了HA作为新资源食品后,HA广泛应用于果汁、豆奶、果冻等食品中[10],但将HA作为天然涂膜材料应用于食品贮藏的研究还鲜有报道,相关研究已将HA涂膜于鲫鱼、鲤鱼肉表面进行保鲜,获得了较好的贮藏效果[11-12]。

明胶和HA是来自于机体的天然物质,作为生物基可食用材料突出的优势是安全、具有多种功能特性,将二者复合创新制备成复合膜,将具有广阔的应用前景,本文进一步研究不同分子量HA对复合膜性质的影响,可为丰富和发展生物基可食性生物活性膜材料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

HA(分子量0.3～1、1～10、10～13、20～40、80～100、130～15、180～220×104Da) 山东福瑞达生物医药有限公司;明胶 天津市光复精细化工研究所;溴化钾 光谱纯,常州市海拓实验仪器有限公司;其它试剂 均为分析纯。

752紫外可见分光光度计 上海析谱仪器有限公司;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;FW-4A压片机 天津市光学仪器厂;WS70-1红外线快速干燥器 上海锦屏仪器仪表有限公司;TENSOR27傅立叶红外光谱仪 德国BRUKER科学仪器公司;CR-400/410色差仪 日本柯尼卡美能达控股株式会社。

1.2 试验方法

1.2.1 复合膜制备 分别称取7种不同分子量的HA各0.01 g,分别加入10 mL去离子水,搅拌1 h至完全溶解,制得质量分数为0.1%的HA溶液;称取明胶0.6 g,加入10 mL去离子水,40 ℃下搅拌30 min至完全溶解,制得质量分数为6%的明胶溶液。将制备好的HA溶液与明胶溶液混合均匀,加入20%(W/V)的甘油,于40 ℃下水浴搅拌2 h,制得HA-明胶复合膜膜液。25 ℃温度下,将膜液真空脱气(真空度0.098 MPa,时间30 min)以除去复合膜溶液中的气泡。取上述复合膜液10 mL均匀完整的铺展于干燥洁净的有机玻璃板(10.5 cm×4.5 cm)上,在鼓风干燥箱内24 ℃,300 min烘干。干燥后将膜揭下,于温度为20 ℃,相对湿度为53%(饱和Mg(NO3)2溶液)的干燥器内保存备用。

1.2.2 HA-明胶复合膜的性能研究

1.2.2.1 膜厚度的测定 利用游标卡尺在待测膜的四个边缘位置以及中心位置取5点,测其厚度,得到的平均值为膜的厚度[13]。

1.2.2.2 膜密度的计算 取膜试样,先测量其厚度,然后用分析天平称重,通过测量试样的表面积,计算膜的密度[3]。

式中:ρ表示密度,g·cm-3;m表示试样质量,g;d表示试样厚度,cm;s表示试样面积,cm2。

1.2.2.3 膜不透明度的测定 将试样膜裁成1 cm×4 cm的样条贴于比色皿内壁中,在500 nm处测定试样膜的吸光度,以未放置膜的比色皿作为参照样。试样膜的透光性用不透明度表示,计算公式如下[3]。

式中:O表示不透明度,A·mm-1;OD500表示试样在500 nm的吸光度,A;d表示试样厚度,mm。

1.2.2.4 膜颜色的测定 仪器经校准后(L*=52.94,a*=-0.50,b*=4.85),用手握住色差仪,将色差仪垂直放在复合膜表面,每测量一次后,记录好数据并用擦镜纸擦干色差仪的镜头表面,每次放置的力度保持均匀,每个复合膜最少测3次,白度用ΔE表示,颜色指数是L=0(黑色)到L=100(白色),-b(蓝色)到+b(黄色),-a(绿色)到+a(红色),计算公式如下[7]。

1.2.2.5 膜水分含量的测定 复合膜水分含量用烘干后损失的重量计算。试样为1 cm×4 cm样条,在相对湿度为75%的环境中放置48 h平衡水分后取出称重记为Mw,然后将试样放入温度为(105±1) ℃的鼓风干燥箱内干燥24 h后取出称重记为Md。平行实验3次,水分含量的计算公式如下[3]。

式中:H表示水分含量,%;Mw表示试样相对湿度为75%的环境中平衡48 h后的质量,g;Md表示试样烘干24 h后的质量,g。

1.2.2.6 膜溶解性的测定 将膜放在70 ℃鼓风干燥箱中干燥24 h,作为膜的初始干重M0,将膜取出放入去离子水中10 min后,将膜和去离子水混合物倒入漏斗中沥干多余水分,将剩余膜片再次放入70 ℃鼓风干燥箱内干燥24 h,作为膜最终的干重M1,以R表示膜的溶解性[14]。

式中:R表示溶解性,%;M0表示膜70 ℃鼓风干燥箱中干燥24 h后重量,g;M1表示膜溶解10 min后烘干24 h后的重量,g。

1.2.2.7 膜水蒸气透过率的测定 用称量瓶(半径1.8 cm×2.3 cm)测量复合膜水蒸气透过率,先用移液管移取10 mL去离子水于干净称量瓶中,然后将复合膜剪成合适大小将称量瓶口封住。再将称量瓶放入25 ℃装有变色硅胶的干燥器中,每隔2 h称一次重量,总共称量6次[15],计算试样的水蒸气透过率(WVP)。

式中:WVP表示水蒸气透过率,g·mm/h·m2·kPa;Am表示质量的增量,g;At表示测定的时间间隔,h;Ap表示膜两侧的水蒸气压差,25 ℃时为3.168 kPa;A表示称量瓶口面积,m2;d表示复合膜厚度,mm。

1.2.2.8 膜抗拉强度的测定 使用物性测试仪测定抗拉强度,试样为2 cm×6cm样条,探头初始间距为40 mm,拉伸速率为 1 mm/s,抗拉强度的计算公式如下[16]。

TS=F/S

式中:TS表示抗拉强度,MPa;F表示试样膜断裂时最大拉力,N;S表示试样的横截面积,mm2。

1.2.2.9 傅立叶变换红外光谱扫描 复合膜冻干品的红外光谱采用反射来进行测试,将冷冻干燥后的膜剪取少量加入干燥后的溴化钾研磨,放入红外反射台上压实,然后进行测试,扫描范围400～4000 cm-1,分辨率0.5 cm-1,扫描次数:75 次/s[17]。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0 统计分析软件对不同分子量HA制成的复合膜理化性质进行单因素方差分析与相关性分析,检验水平P值小于0.05时为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 HA分子量对复合膜厚度、密度的影响

2.1.1 不同分子量HA对复合膜厚度的影响 膜的厚度过大或过小均会影响膜的透明度、水蒸气透过率等性能,所以合适厚度的复合膜能够维持膜的最佳性能。HA-明胶复合膜的厚度范围为0.070～0.093 mm,随着HA相对分子量的增大,HA-明胶复合膜的厚度呈现先增大后减小的趋势,见图1。

图1 不同分子量HA对复合膜厚度影响Fig.1 Effect of different molecular weight HAon the thickness of composite film注:不同小写字母表示数据之间存在显著性差异(P<0.05);图2～图7同。

当HA分子量为0.3～40×104Da范围时,随着HA分子量的增加,复合膜的厚度逐渐增加,HA分子量为0.3～1×104Da时,复合膜的厚度最小,为0.070 mm,HA分子量为20～40×104Da时,复合膜的厚度最大,为0.093 mm,二者厚度相比差异显著(P<0.05)。可能是由于HA分子量逐渐增大,复合膜中羟基含量增大,亲水的氢键增加,其厚度也随之增加。当HA分子量大于80×104Da时,随着分子量增加,复合膜的厚度逐渐减小。HA分子量较高时,复合膜中HA与明胶交联形成强烈的氢键作用破坏了HA的规整结构,使其结晶度下降[6],进而导致复合膜成膜性下降,结构分散,导致厚度略微减小[18]。

2.1.2 不同分子量HA对复合膜密度的影响 复合膜的密度的也是影响膜的均一性与透明度的重要因素之一。HA-明胶复合膜的密度范围在0.68～0.79 g·cm-3,随着HA分子量的增大,密度呈现先增大后减小的趋势,见图2。

图2 不同分子量HA对复合膜密度的影响Fig.2 Effect of different molecular weight HAon the density of composite film

HA分子量为0.3～1×104Da时,复合膜密度达到最小,为0.68 g·cm-3。HA分子量在0.3～40×104Da范围时,复合膜的密度差异不显著(P>0.05),HA分子量为80～100×104Da时,复合膜的密度增加,与其他处理之间差异显著(P<0.05),由于HA与明胶发生交联作用使复合膜结构越来越紧密,导致复合膜的水分含量减小、厚度减小[18],因此密度不断增大。由于HA与壳聚糖均属于多糖类物质,分子量越大所形成的成膜液越粘稠,搅拌时易产生大量气泡难以去除,致使复合膜密度降低[7]。

2.2 HA分子量对复合膜不透明度、颜色的影响

2.2.1 不同分子量HA对复合膜不透明度的影响 复合膜的透明度是判断共混高分子相容性好坏的辅助手段,本试验透光性用不透明度表示。如图3,HA分子量为0.3～100×104Da范围时,随着分子量的增加,膜的不透明度呈现上升趋势,HA分子量0.3～1×104Da时,透明度最小为10.80 A·mm-1;HA分子量为80～100×104Da时,膜的不透明度达到最高,为27.45 A·mm-1,与其他分子量HA复合膜的不透明度之间差异显著(P<0.05);HA分子量在130～220×104Da范围内,膜不透明度呈现下降趋势。HA分子量影响复合膜不透明度,分子量大的HA复合膜液的粘度较大,膜液中含有较多气泡导致其不透明度增大。多糖复合膜的规整结构受到破坏后,复合膜的非晶区与晶区之间的界面发生光散射增多增大,会改变复合膜的不透明度[7]。HA分子量为80～220×104Da时,HA与明胶之间形成的氢键越来越强,削弱了HA分子中-NH2与-OH 间的氢键作用,HA结晶度变小[7],所以不透明度不断下降。

图3 不同分子量HA对复合膜透明度的影响Fig.3 Effect of different molecular weight HAon the opacity of composite film

表1 不同分子量的HA对复合膜颜色的影响Table 1 Effect of different molecular weight HA on the color of composite film

注:不同小写字母表示数据之间存在显著性差异(P<0.05)。

2.2.2 不同分子量HA对复合膜颜色的影响 包装膜的颜色是影响包装产品外观的重要因素之一,不同颜色的包装膜会影响人们对食品的感官感受。因此,需要对HA-明胶复合膜的颜色进行测定。由表1可知,随着分子量的增大,HA-明胶复合膜ΔE略有提高。

HA分子量的增加,使HA-明胶复合膜的颜色发生了变化,红度a*值减小,黄度b*值增大,这是由于HA中含有还原性基团,与明胶发生美拉德反应,导致复合膜黄化。随着HA分子量的增加,HA-明胶复合膜颜色变化差异不显著(P>0.05)。

2.3 HA分子量对复合膜水分含量、溶解性、水蒸气透过率及抗拉强度的影响

2.3.1 不同分子量HA对复合膜水分含量的影响 复合膜的水分含量是影响包装食品的重要因素之一,水分含量过大时,会加速食品的腐败变质,水分含量过小会影响膜本身的性能。

如图4,HA分子量在0.3～40×104Da范围时,复合膜水分含量随其分子量增加呈现升高趋势,HA分子量为0.3～1万时,复合膜水分含量最小为15.91%;分子量为20～40×104Da时,复合膜水分含量达到最大,为22.53%,与其他分子量HA复合膜水分含量差异显著(P<0.05)。高分子HA中含有较多的羟基,这些羟基可以与水形成氢键后结合大量的水,固定并阻止水流动,从而使复合膜水分含量增大[6]。HA分子量在80～220×104Da时,随HA分子量的增加,复合膜水分含量呈现下降的趋势,这是因为HA达到一定分子量时,不再以独立的单体存在,HA分子间相互缠绕,形成致密的网状结构,所以水分含量降低[19-20]。

图4 不同分子量HA对复合膜水分含量的影响Fig.4 Effect of different molecular weight HAon the moisture content of composite film

2.3.2 不同分子量HA对复合膜溶解性的影响 随着HA分子量的增加,复合膜的水溶性逐渐降低,在HA分子量为0.3～1×104Da时,复合膜的溶解性最大,为63.99%,与其他分子量HA复合膜水分含量差异显著(P<0.05),见图5。

图5 不同分子量HA对复合膜溶解性的影响Fig.5 Effect of different molecular weight HAon the solubility of composite film

HA多元醇分子中的-OH与明胶分子中的-OH、-NH2、-C=O 形成氢键,增强了大分子链间的相互作用力,可以使复合膜的致密性变强,交联化学键的强度更大,复合膜表面亲水性下降[6]。随着HA分子量的增加,HA分子中的羟基不断增多,与明胶分子形成更多的氢键,导致复合膜表面亲水性下降,所以复合膜溶解性逐渐降低。由于复合膜溶解性相对较强,因此较适合于鲜切畜禽肉类的涂膜,该涂膜技术已应用于淡水鱼肉的保鲜中,并取得了良好的效果[11-12,21]。

2.3.3 不同分子量HA对复合膜水蒸气透过率的影响 水蒸气透过率直接影响包装食品的质量,水蒸气透过率越低,包装膜的防腐效果越好,越有利于延长食品保质期。

如图6,HA分子量在0.3～100×104Da时,复合膜的水蒸气透过率逐渐减小,HA分子量0.3～1×104Da时,水蒸气透过率最高为5.69 g·mm/h·m2·kPa;HA分子量为80～100×104Da时,水蒸气透过率最低,为4.41 g·mm/h·m2·kPa。复合膜的结构紧密会引起通透性下降,随着HA分子量增加,与明胶形成氢键增强,使复合膜结构紧密,从而减少水分子在复合膜中的传输与扩散、通透性下降,导致水蒸气透过率减小。HA分子量在130～220×104Da范围时,水蒸气透过率略有增大,高分子量的HA中亲水性基团增多,促使复合膜吸水溶胀后引起膜结构疏松,导致复合膜的通透性提升[18]。

图6 不同相对分子量HA对复合膜水蒸气透过率的影响Fig.6 Effect of different molecular weight HAon the water vapor transmission rate of composite film

2.3.4 不同分子量HA对复合膜抗拉强度的影响 如图7,HA分子量在0.3～100×104Da范围时,复合膜的抗拉强度逐渐增加,HA分子量为0.3～1×104Da时,抗拉强度最低为13.23 MPa;HA分子量为80～100×104Da时,抗拉强度最高,为17.07 MPa,与其他复合膜抗拉强度差异(P<0.05)。复合膜的抗拉强度随着HA分子量增加而增加,HA分子量逐渐变大,其与明胶形成氢键增强,使复合膜结构紧密,抗拉强度增强。

图7 不同相对分子量HA对复合膜抗拉强度的影响Fig.7 Effect of different molecular weight HAon the tensile strength of composite film

2.4 复合膜的红外光谱分析

HA分子链上的羟基、N-乙酰氨基可以形成很多种分子内和分子间的氢键,如C3-OH与糖苷基间的分子内氢键、C3-OH与相邻分子链上糖苷基的分子间氢键、其他基团形成的C=O…H-O和N-H…O=C等[7],这些氢键的产生使得HA的红外光谱的各特征峰位出现了一定的移动。

傅立叶红外光谱可反映出不同分子量HA与明胶的结合状态,见图8。不同分子量HA-明胶复合膜在酰胺A区的最大吸收峰范围位于波数3390～3425 cm-1之间,最大吸收峰为3396 cm-1,通常酰胺A区最大吸收峰位于波数 3400～3440 cm-1之间,主要为N-H和O-H伸缩振动,当N-H与氢键缔合后,吸收峰向短波迁移[22]。因此可知,HA分子与明胶分子之间发生氢键交联,使酰胺A区最大吸收峰产生短波位移。0.3～1×104Da分子量,1～10×104Da分子量HA与明胶复合膜在波数3396 cm-1处峰形变为宽钝峰,可能是N-H振动峰和O-H振动峰重叠,增加了成膜组分间的氢键作用。而增塑剂甘油的添加,可能也会促进其与明胶中的羟脯氨酸的Pro-NH键发生反应,形成更多氢键[23]。

图8 七种不同分子量HA-明胶复合膜的红外光谱Fig.8 Infrared spectra of seven differentmolecular weight HA-gelatin composite films注:A:0.3-1×104 Da;B:1-10×104 Da;C:10-13×104 Da;D:20-40×104 Da;E:80-100×104 Da;F:130-150×104 Da;G:180-220×104 Da。

HA-明胶复合膜在酰胺B区最大吸收峰位于波数2925～2935 cm-1以及2879～2883 cm-1,分别为CH2不对称伸缩振动和CH2对称伸缩振动[24-25]。分子量大于130×104Da的HA与明胶复合膜在酰胺B区最大吸收峰强度有所增大,基团振动强度增大,可能与高分子量的HA中CH2振动有关。

红外光谱图中酰胺Ⅰ区的特征吸收峰表示为多肽骨架的C=O伸缩振动,以及HA乙酰基上的 C=O 伸缩振动,波数为1650～1658 cm-1;酰胺Ⅱ区吸收峰表示为 N-H键的弯曲振动和角变形,波数在1548～1550 cm-1之间,酰胺Ⅲ区吸收峰表示为C-N 键的伸缩振动,波数在1240～1244 cm-1之间。红外光谱图中1043、1110、923 cm-1左右的吸收峰为糖的特征吸收峰[26]。

3 结论

本文考察了不同分子量透明质酸-明胶复合膜的理化性能,并对其结构变化进行了分析。

HA分子量为0.3～1×104Da时,复合膜厚度、密度和水分含量最小,分别为0.070 mm、0.68 g·cm-3、15.91%,不透明度最小为10.80 A·mm-1,水蒸气透过率最高为5.69 g·mm/h·m2·kPa;HA分子量为20～40×104Da时,复合膜厚度达到最大为0.093 mm,水分含量最大为22.53%;HA分子量为80～100×104Da时,复合膜密度最大0.79 g·cm-3,不透明度最大为27.45 A·mm-1,蒸气透过率最低为4.41 g·mm/h·m2·kPa。

HA分子量大于80～100×104Da时,复合膜的抗拉强度明显提高,红外光谱分析发现HA与明胶分子间具有氢键作用,说明透明质酸与明胶之间能够很好地互溶,形成紧密结构,制备成安全、性能优良的保鲜膜。后续还需进一步优化HA-明胶复合膜的制备工艺,深入分析HA与明胶的相互作用关系,以及复合膜的释放性对鲜切鱼、禽、畜产品的保鲜效果的影响,有望开发一种潜在的食品内包装膜。