响应面法优化山豆根多糖提取工艺及其分级醇沉组分的抗氧化活性

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(1.广西民族大学化学化工学院,广西林产化学与工程重点实验室,广西南宁 530008;2.广西民族大学海洋与生物技术学院,广西海洋微生物资源产业化工程技术研究中心,广西南宁 530008)

在自然界许多生物体内产生能源燃料的生物过程中,氧化是必不可少的环节。但是,过量活性氧的产生对细胞是有害的,它不仅会加快机体衰老,还可能引起癌症、心脏病、动脉粥样硬化、炎症、帕金森以及老年痴呆症等多种疾病[1]。为减少活性氧对人体的氧化损伤,许多抗氧化剂被合成并得到了广泛的应用。然而,有研究表明,合成抗氧化剂对健康具有潜在危害,如引发肝脏损伤和致癌等[2]。与合成抗氧化剂相比,天然抗氧化剂具有低毒性、易被人体吸收的特点。因此,开发和利用有效的天然抗氧化剂,对预防疾病和改善人体健康具有特殊的意义。

山豆根为豆科槐属植物越南槐(SophoratonkinensisGagnep.)的干燥根及根茎,属于广西大宗药材之一。研究表明,山豆根含有丰富的生物碱、黄酮、多糖、皂苷等化学成分[3-6],而且山豆根总提取物具有抗肿瘤、抗炎抑菌、抗心律失常和抗氧化等多种活性[7-10]。植物多糖具有多种生物活性,近年来受到越来越多的关注。从山豆根中提取的多糖具有抗肿瘤[11],免疫调节[12-13],抗氧化[14]等生理保健作用。有研究报道,通过分级醇沉将多糖初步纯化,并基于生物活性导向的研究有利于多糖的进一步开发[15-17]。

目前,关于山豆根多糖分级醇沉和抗氧化的研究较少,本研究采用响应面法优化山豆根粗多糖(SGP)的提取工艺,经醇沉分级,将粗多糖初步分组纯化,并比较各组分的抗氧化活性,旨在筛选出较好的抗氧化活性多糖分级组分,为山豆根多糖的研究及开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山豆根 产地广西靖西,广西南宁市一心药店;D-葡萄糖 阿拉丁试剂有限公司;DPPH、ABTS Sigma aldrich公司;2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、无水乙醇、95%乙醇、浓硫酸、苯酚、过硫酸钾、三氯乙酸、铁氰化钾、三氯化铁等 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

UV-5100紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;RE-2000A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SCIENTZ-12ND冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;实验室超纯水器 成都优越科技有限公司;HH-S型恒温水浴锅 巩义市予华仪器有限责任公司;循环水式真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 山豆根粗多糖的提取及分级醇沉工艺流程 山豆根→粉碎,过60目→95%乙醇浸泡12 h,去除脂肪→抽滤→残渣热水浸提→抽滤→滤液浓缩→75%乙醇沉淀→抽滤→沉淀→冷冻干燥→山豆根粗多糖→分级醇沉→山豆根多糖不同醇沉组分。

1.2.2 单因素实验 山豆根多糖为水溶性多糖,易溶与水,本实验采用水提醇沉法,考察各因素对山豆根多糖得率的影响。

1.2.2.1 提取温度对多糖得率的影响 固定提取时间为2.5 h,液料比为20∶1 (mL/g),考察不同提取温度60、70、80、90、100 ℃对多糖得率的影响。

1.2.2.2 提取时间对多糖得率的影响 固定提取温度为80 ℃、液料比为20∶1 (mL/g),考察不同提取时间60、90、120、150、180 min对多糖得率的影响。

1.2.2.3 液料比对多糖得率的影响 固定提取温度为80 ℃、提取时间为2 h,考察不同液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 (mL/g)对多糖得率的影响。

1.2.3 响应曲面试验 在单因素实验的基础上,运用Design Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken设计,以SGP得率为响应值,采用三因素三水平的响应面分析法优化山豆根多糖的提取工艺,各因素水平设计见表1。

表1 响应面实验设计因素水平表Table 1 Factors and levels used in the RSM design

1.2.4 分级醇沉 用超纯水溶解SGP,离心(4000 r/min,5 min),去除不溶杂质。在上清液中加入无水乙醇使得乙醇体积分数达到50%,置于4 ℃ 冰箱中醇沉12 h以上,离心(4000 r/min,10 min,4 ℃),将沉淀置于冷冻干燥机冻干,得到灰白色粉末,定义为SGP 50。将上个步骤中过滤后得到的滤液加入无水乙醇,使乙醇体积分数达到70%,同法操作制得70%醇沉组分,即SGP 70;接着制得SGP 80和SGP 90。

1.2.5 多糖得率的计算 按“1.2.1,1.2.4”项方法操作得到SGP及各级醇沉多糖,冷冻干燥后,称重并按下列公式计算得率。

多糖得率(%)=[多糖质量(g)/原料质量(g)]×100

1.2.6 多糖纯度的测定 采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[18],分别取配制好的粗多糖及各级醇沉多糖样品溶液1.0 mL,加入5%苯酚1.0 mL,混匀后加入浓硫酸5 mL,震荡摇匀。混合物在沸水浴中加热15 min后,取出冷却至常温,于490 nm测吸光值。以D-葡萄糖为标准品,做标准曲线,拟合得回归方程:Y=0.0091X+0.0668,R2=0.9991(其中,X为样品浓度,Y为吸光值,线性浓度范围:10～100 μg/mL)。利用标准曲线方程计算出样品溶液中多糖的含量,并计算多糖纯度。

多糖纯度(mg/g)=多糖含量(mg)/各级多糖冻干质量(g)

1.2.7 抗氧化活性测定

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的测定 参照文献[19],精密称取SGP和各醇沉多糖,配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的样品溶液,配好0.1 mmol/L 的DPPH乙醇溶液,以BHT(浓度为0.09、0.11、0.13、0.15、0.17 mg/mL)为对照品。分别吸取5 mL DPPH乙醇溶液和样品溶液,混合摇匀,避光放置30 min,分光光度计吸收波长调至517 nm,测定吸光值,记为A1;另取样品溶液和无水乙醇各5 mL,同法测定吸光值,记为A2;取同体积的 DPPH乙醇溶液和无水乙醇混合,测得的吸光值记为A0。按下列公式计算清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.2.7.2 ABTS+自由基清除能力的测定 根据文献[20],配制ABTS工作液(将7 mmol/L的ABTS乙醇溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合,室温下避光放置16 h后,用70%乙醇(v/v)调至734 nm的吸光值为0.700±0.02)。精密吸取ABTS工作液2.5 mL,SGP和各醇沉多糖的样品溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)1.5 mL,室温下反应6 min,于734 nm波长处测吸光值,记为A样,ABTS工作液与70%乙醇(v/v)溶液混合测得的吸光值为A空,以BHT(浓度为0.07、0.09、0.11、0.13、0.15 mg/mL)为对照品,清除率计算公式为:

ABTS+自由基清除率(%)=(A空-A样)×100/A空

1.2.7.3 还原能力的测定 配制好浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的SGP和各醇沉多糖的样品溶液和BHT溶液(浓度为0.004、0.008、0.012、0.016、0.200 mg/mL)。参照文献[21],分别吸取2.0 mL各多糖溶液和BHT溶液,加入0.2 mol/L pH6.6磷酸缓冲液2.5 mL,再加1%的铁氰化钾溶液2.5 mL,50 ℃水浴20 min后冷却,加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL,于4000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL,加蒸馏水2.5 mL,0.1%的三氯化铁溶液0.5 mL,混合10 min后于700 nm波长处测定吸光度。还原能力的强度用3次测定的吸光度平均值来表示。

1.3 数据处理

所有样品均重复3次实验操作,运用软件Design Expert 8.0.6和SPSS 17.0进行实验设计和数据分析,测定结果以平均值±标准差表示,并采用Origin 7.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度对SGP得率的影响 如图1所示,SGP得率随着温度升高而增加。当温度大于80 ℃时,SGP得率的增加趋于平缓,提取温度90和100 ℃时的SGP得率与80 ℃时无显著性差异(P>0.05),其原因可能是,在一定范围内,升高提取温度可使山豆根与水分子的相互作用速率增加,使水溶性多糖更易于从细胞壁中溶出,从而提高了多糖的得率。继续升高提取温度,SGP得率增加不显著。因此,本实验定80 ℃为提取温度的中心点。

图1 提取温度对SGP得率的影响Fig.1 Effect of temperature on the extraction rates of SGP

图2 提取时间对SGP得率的影响Fig.2 Effect of time on the extraction rates of SGP

2.1.2 提取时间对SGP得率的影响 本研究考察了不同的提取时间对SGP得率的影响,如图2所示,当提取时间为60～120 min时,得率的变化相对较大。SGP得率随提取时间的延长而增加,在120 min时达到最大值,然后随提取时间的延长而略有下降。推测较长的提取时间有利于多糖的产生,但是,继续延长时间,SGP得率变化不明显[22],因此,本实验定120 min为提取时间的中心点。

2.1.3 液料比对SGP得率的影响 如图3所示,随着液料比的增加,SGP得率逐渐上升,原因可能是随着水的比例的增加,多糖成分可以完全溶解在水中。当液料比为30∶1 mL/g时,得率达到最大值;大于30∶1 mL/g时,得率稍有下降,推测原因是液料比为30∶1 mL/g时,多糖提取量已基本饱和,此后溶剂用量增加导致原料的物质分子间相互作用减弱[23],多糖得率略有下降。因此,在响应面试验设计中,定30∶1 mL/g为液料比的中心点。

图3 液料比对SGP得率的影响Fig.3 Effect of liquid-material ratioon the extraction rates of SGP

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 试验结果与回归方程 以单因素实验结果为基础,利用Design-Expert 8.0.6软件设计试验优化SGP的提取条件,由数据分析得到SGP得率自变量与相关变量之间关系的拟合方程为:得率(%)=3.95+0.43A+0.45B+0.39C+0.13AB-0.09AC-0.41BC-0.75A2-0.48B2-0.55C2。通过该方程可以计算试验的预测值,如表2所示。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and result of RSM

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注:“*”表示差异显著,P<0.05;“**”表示差异极显著,P<0.01。

2.2.2 回归模型的方差分析 表3总结了拟合优度、方差和模式充分性的分析结果。从表3可以看出,该模型具有极低的P值(P<0.0001),表明模型具有显著性;而失拟项在α=0.05水平上不显著(P>0.05),表明该方程对实验拟合情况好,实验误差小。相关系数R2为0.9903,表明SGP得率的实验值与预测值之间一致性很高,模型预测性好。模型的信噪比为24.925(>4),说明方程的拟合度很高,该模型可用于预测。此外,系数变异值CV(3.84%)较低,表明实验的精确度较高,重复性好。对SGP提取的影响极显著的因素有一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2及交互项BC。通过比较F值的大小,可得出影响SGP得率大小的因素顺序为:提取时间>提取温度>液料比。

2.2.3 响应曲面分析 从响应面图上可以直观地看出各因素对SGP得率的影响及各因素间交互作用对SGP得率影响的显著程度。响应面曲面的坡度直接反映了在处理条件下发生变化时SGP得率的响应灵敏程度;等高线为椭圆形则说明两因素交互作用显著[24]。从图4a,图4b可看出,其等高线接近圆形,说明两因素交互作用对SGP的提取影响不显著;而图4c的曲面图曲线比较陡峭,等高线为椭圆形,表明提取时间与液料比的交互作用对SGP的提取影响显著。响应面图分析结果与模型方差分析结果具有一致性。

图4 两因素交互作用对SGP得率影响的响应面图Fig.4 Response surface diagram oftwo factors interaction on the yield of SGP

2.3 验证实验

由响应面试验的优化得到SGP最佳提取条件为:提取温度83.15 ℃,提取时间133.4 min,液料比31.61∶1 mL/g。为了便于实际操作,将SGP的最佳提取工艺参数修正为:提取温度为83 ℃,提取时间为133 min,液料比为30∶1 mL/g,进行三组重复性验证实验,得到SGP的平均得率为3.98%±0.15%,与模型预测值4.15%较接近,表明该模型预测性良好。此时多糖纯度为(207.8±14.2) mg/g。

2.4 山豆根多糖各组分得率及含量

从表4可以看出,各级醇沉组分中,SGP 50得率最高,显著高于其他醇沉组分(P<0.05)。山豆根多糖各组分的多糖纯度最高的是SGP 50,最低的是SGP 90,纯度顺序依次为SGP 50>SGP>SGP 70>SGP 80>SGP 90。

表4 山豆根多糖各组分得率及多糖含量Table 4 Yield and contents of SGPpolysaccharide of different components

注:同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.5 抗氧化活性分析

2.5.1 清除DPPH自由基能力 从图5可看出山豆根多糖各组分对DPPH自由基均有一定的清除作用,且呈量效关系。当多糖质量浓度在0.2 mg/mL时,SGP的清除能力优于同浓度的其它醇沉组分。当多糖质量浓度在0.4～1.0 mg/mL范围内时,SGP 90的清除DPPH自由基的能力最强,接着依次是SGP、SGP 50、SGP 70,SGP 80的清除能力最弱。而对照品BHT在较低浓度时已表现出较好的清除DPPH自由基的能力。综上,SGP 90具有较其它组分较好的清除DPPH的能力,但其清除能力低于BHT。

图5 山豆根多糖各组分和BHT对DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect on DPPHfree radical of SGP and BHT

2.5.2 清除ABTS+自由基能力 从图6可看出SGP各组分在实验质量浓度范围内对ABTS+自由基均有一定的清除作用,呈量效关系。在实验中,SGP 90对ABTS+自由基的清除能力最强,SGP 80的最弱,各组分清除ABTS+自由基能力的强弱顺序与清除DPPH自由基实验结果相似。,说明SGP各组分对ABTS+自由基能达到相同的清除效果。而相同浓度下,对照品BHT具有显著高于SGP各组分的清除ABTS+自由基的能力(P<0.05)。

图6 山豆根多糖各组分和BHT对ABTS自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect on ABTSfree radical of SGP and BHT

2.5.3 还原力 从图7可看出SGP各组分均具有一定的还原能力,且呈量效关系。在实验质量浓度范围内,SGP 90的还原能力最强,SGP 80的最弱,SGP 50与SGP的还原能力接近,与清除DPPH、ABTS+自由基实验结果相似,而相同浓度下,对照品BHT的还原能力显著高于山豆根多糖各组分(P<0.05)。

图7 山豆根多糖各组分和BHT的还原能力Fig.7 Reducing power of SGP and BHT

从以上抗氧化活性实验结果可以看出,山豆根多糖各组分清除DPPH、ABTS+自由基的能力和还原能力的大小顺序是一致的,作用强弱依次为:SGP 90>SGP>SGP 50>SGP 70>SGP 80。SGP 90的抗氧化活性最强,然而,从表4可以看出SGP 90的多糖纯度是几个分级醇沉组分中最低的,推测SGP及各级组分的抗氧化活性不仅与多糖纯度有关,还可能与山豆根中的其他活性成分有关。

3 结论

本实验采用响应面法来优化SGP的提取工艺,结果表明最佳提取工艺为:提取温度83 ℃,提取时间133 min,液料比30∶1 mL/g。在此基础上进行验证实验,实测多糖得率为3.98%±0.15%,接近预测的得率(4.15%),说明该模型能较好地预测各因素与SGP得率之间的关系。体外抗氧化研究结果表明,山豆根多糖各组分均有一定的抗氧化能力,其中SGP 90的抗氧化活性最强,可作为下一步目标进行深入研究。造成SGP各醇沉组分抗氧化能力差异的原因可能是由不同体积分数乙醇沉淀得到的多糖分子量不同、极性不同、结构组成不同,还可能与提取物中含有其他活性成分有关,其确切原因尚待进一步研究。