污水中絮凝细菌的分离及鉴定

雒晓芳1,苏 强,陈丽华3,*,张 巍,田瑜琳

(1.西北民族大学实验教学部,甘肃兰州 730030;2.西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;3.西北民族大学化工学院,甘肃兰州 730030)

我国城市化进程发展越来越快,水资源需求量也越来越大,水污染的程度也在大大的加深,污水处理就成了目前急需解决的大问题。絮凝沉淀法与生物处理、离子交换、吸附、化学氧化、电渗析、超滤和等方法相比较之下较为廉价、操作更为简便。研究发现能够产生絮凝剂的微生物种类很多[1],有文献报道的絮凝微生物种类已达50多种。常见的细菌微生物絮凝剂产生菌有荧光单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粪便假单胞菌(Pseudomonasfaecalic)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、粪便产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)等[2]。目前,在微生物处理水污染取得一定的进展,现有很多生物科技公司已应用污水的处理。吴迪[3]研究发现在污水中分离出的低温菌种在适宜的环境条件下对污水COD、总磷去除率高达50%;曹惠忠等[4]研发出一种微生物处理污水的工艺,对污水有明显的净化,且无二次污染;霍前坤等[5]在活性污泥中筛选出几株具有絮凝效果的微生物对污水的絮凝效果十分明显,并研究了其影响絮凝作用的因素。杨劲峰等[6]将微生物絮凝剂M-127用于自来水原水处理,其处理效果优于常规絮凝剂,而且对原水浊度的最大去除率高达93.89%。

因此,微生物絮凝剂作为一类新型絮凝剂,由于具有广谱絮凝活性、可生物降解性以及使用的安全性,显示了其在各种原水、废水及污泥处理过程中的应用前景,已成为国内外新型水处理剂研究和开发的热点[7]。王伟[8]从土壤中筛选出的一株圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)中提取到出絮凝剂GYS-9,该絮凝剂的絮凝率达到90%以上,其絮凝作用总体表现为对黏土类矿物具有较好的絮凝效果,对石英的絮凝过程中,絮凝剂GSY-9对石英主要起到分散作用。絮凝微生物对于煤泥水的絮凝过程,煤泥水中各组分以不同作用力在絮凝剂GSY-9分子上的各吸附位点进行吸附[9-10]。杨琳等[11]从洱海底泥中筛选出的EH-5 菌株,其所产絮凝剂对啤酒废水COD(化学需氧量)、色度、浊度的去除率分别为64.15%、69.57%、95.91%,对乳品废水中 COD、色度、浊度的去除率分别达74.49%、75.00%、93.78%。Xing等[12]采用Klebsiellasp.对去除水溶液中的磺胺甲口恶唑进行了研究,在最优条件下磺胺甲口恶唑的去除率为53.27%。

本文以山东临淄金岭回族镇的污水和淤泥为样品,分离筛选具有絮凝作用的微生物菌株,并通过形态学观察,生理生化特性和分子生物学测定的方法进行了鉴定,希望能为研究絮凝微生物提供良好的菌种资源,并对污水治理提供良好的应用潜能。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验所需污水、淤泥 采自于山东省临淄区金岭回族镇的水渠;营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、细菌生化鉴定管 杭州微生物有限责任公司;无水CaCl2、高岭土、硫酸铝钾(明矾) 化学纯,杭州微生物有限责任公司。

YXQ-LS-立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;DHG-9140A新型电热恒温鼓风干燥箱 宁波江南仪器厂;干燥箱 宁波江南仪器厂;LRH-150B生化培养箱;ZWY-200D恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司;G10S UV-VIS双光束紫外可见分光光度计 Thermo Fisher Scientific有限公司;S.SW-CJ-2F净化工作台 上海跃进医疗器械厂;BA210生物显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 微生物的分离纯化 在污水渠的上中下游三处采集污水和淤泥,装入密封袋4 ℃冰箱保藏。将采集的污水和淤泥分别以(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)七个梯度稀释,每个梯度取100 μL涂布到营养琼脂培养基平板中,30 ℃培养48 h观察。

取涂布平板中不同形态的单个菌落以四区划线法接种在营养琼脂培养基平板上,30 ℃培养48 h后对平板中出现的不同形态的单个菌落进行连续多次的分离划线培养,直至菌落形态稳定且单一,对分离的菌株,通过简单染色,在显微镜下观察其基本形态结构。

1.2.2 絮凝微生物的筛选 硫酸铝钾组:分别取200、400、600、800、1000 mg/L的硫酸铝钾各2 mL,浓度为1%的氯化钙溶液5 mL和4 g/L高岭土悬浊液93 mL于250 mL三角烧瓶中,空白组以2 mL蒸馏水代替2 mL的硫酸铝钾。将三角瓶充分震荡2 min后静置8 min,再用微量加样器吸取上清液,测定OD550值。通过公式(1)计算絮凝率[13-15]。

式(1)

式中:A1:空白组在OD550下的吸光度值;A2:试验组在OD550下的吸光度值。

微生物絮凝组:挑取分离纯化的菌株富集培养:30 ℃、100 r/min条件下,震荡培养48 h得到菌液。以高岭土悬浊液模拟实际废水作为絮凝对象,取4 g/L高岭土悬浊液93 mL,浓度为1%的氯化钙溶液5 mL、菌液2 mL加入250 mL三角瓶中。同时,用2 mL蒸馏水代替2 mL菌液其他条件不变作为空白组。将三角瓶充分震荡2 min后静置8 min,再用微量加样器吸取上清液,测定OD550值。通过公式(1)计算得到絮凝率。

将初筛获得的具有较高絮凝活性的菌种在营养肉汤培养基中30 ℃、100 r/min条件下扩大富集培养,获得絮凝率稳定且遗传效果稳定的菌株。

1.2.3 絮凝细菌的鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定 将筛选得到的菌种接种于营养琼脂培养基上,在30 ℃下培养48 h,对菌株进行革兰氏染色,油镜下观察菌体形态并拍照记录。

1.2.3.2 生化鉴定 对经筛选获得的絮凝作用最优的两株菌以营养肉汤培养基30 ℃下培养24 h至对数生长期,将菌液按照无菌操作技术接入细菌生化鉴定管中,30 ℃、100 r/min条件下震荡培养48 h后进行观察,并记录其结果。

1.2.3.3 分子生物学鉴定 将基因组对16S rRNA进行PCR扩增,引物为16S:27-F:AGAGTTTGATCM TGGCTCAG,1492-R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT PCR。扩增得到的絮凝菌的PCR产物在浓度为1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳,电泳电压设置120 V,电泳时间设置30 min。之后在320 nm波长紫外灯下进行观察,将结果进行拍照、分析,将目的片段进行回收,送于武汉金开瑞生物工程有限公司做序列测序。

图1 各菌株划线培养Fig.1 The sub-culture plates of strains

表1 各菌株形态特征Table 1 Morphology characteristics of strains

PCR体系条件:H2O 17.8 μL,DNA Buffer 3 μL,dNTP 2 μL,上下引物均3 μL,DNA模板1 μL,DNA聚合酶0.2 μL,总体积30 μL。

PCR扩增条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s;60 ℃ 30 s;72 ℃ 1 min;35次循环;72 ℃ 10 min;12 ℃ 保存。

1.3 数据处理

将测序结果进行正反序列拼接得到全序列,再将测序结果经NCBI进行Blast比对,选择与比对序列相似度高的菌株,以MEGA5.1软件进行分析。利用MEGA 5.0软件进行分析,并构建系统发育树[16-17]。

2 结果与分析

2.1 各菌株的形态学特征

经分离纯化所得的20株菌株进行革兰氏染色确定菌体形状。划线菌落形态见图1,单菌落形态学描述见表1。菌株ZF1、ZF2、ZF3、ZF5、ZF8、ZF12、ZF15、ZF18和ZF20均为杆状细菌,其他均为球状;各菌落形态以圆形为主,且光滑湿润;各菌落颜色多样,大小不一。

2.2 菌株絮凝率比较

由图2可知,硫酸铝钾浓度从200～1000 mg/L时,絮凝率持续上升,当硫酸铝钾浓度为1000 mg/L时,絮凝率达到最高值,为58.91%,硫酸铝钾浓度在1000～1200 mg/L时,絮凝率下降。由表2可知,20株菌的絮凝率与硫酸铝钾絮凝率接近的只有两株,分别为:ZF 1和ZF18,其絮凝率分别为57.68%、57.20%,其他18株的絮凝率均较低。

图2 硫酸铝钾絮凝率Fig.2 The flocculation rate of KAl(SO4)2

试验号B(絮凝率/%)试验号B(絮凝率/%)空白-ZF 1123.78ZF 157.68ZF 1244.41ZF 237.31ZF 1351.85ZF 340.53ZF 1431.62ZF 430.00ZF 1541.47ZF 54.90ZF 1651.03ZF 642.23ZF 1722.95ZF 727.29ZF 1857.20ZF 842.06ZF 1945.60ZF 936.57ZF 2048.46ZF 1038.04

2.3 两株菌的形态学结果

2.3.1 革兰氏染色 将复筛得到的两株菌絮凝能力最强的菌株进行革兰氏染色观察,结果如图3所示。由图3可知,ZF 1为革兰氏阴性短杆菌,ZF18为革兰氏阳性长杆菌。

图3 ZF 1(左)和ZF18(右)的革兰氏染色 Fig.3 Gram stain of the strains

2.3.2 生理生化特性 由表3可知,ZF1分解麦芽糖、甘露醇、棉籽糖和山梨醇,不分解蔗糖、卫矛醇、肌醇和乳糖;氧化酶没反应可能为肠杆菌科;靛基质无反应;可产生DNA酶;硝酸盐未还原;枸橼酸盐阴性为肠杆菌科的埃希菌属、志贺菌属和爱德华菌属等;硫化氢为阴性可排除爱德华菌属;明胶未液化;O/F实验阳性发酵型,进一步确认为肠杆菌。ZF18不分解麦芽糖、甘露醇、棉籽糖、山梨醇、蔗糖、卫矛醇、肌醇和乳糖;氧化酶阳性为假单胞菌;靛基质有气泡;可产生DNA酶;硝酸盐被还原;枸橼酸盐为阳性;O/F实验为阴性;硫化氢为阳性;明胶液化进一步确定其为假单胞菌。

表3 两株菌的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemicalcharacteristics of these two strains

注:+代表反应呈阳性;-代表 反应呈阴性。

2.4 分子生物学鉴定

2.4.1 ZF 1和ZF18的PCR扩增 将筛选得到的两株菌絮凝能力较强的菌株ZF1和ZF18进行分子生物学鉴定,结果如图4所示,可知,ZF1的扩增条带大约为500 bp左右,ZF18的扩增条带为1800 bp左右。

图4 ZF 1和ZF18的 PCR产物电泳图Fig.4 Electropherogram of PCR products of ZF 1 and ZF18

2.4.2 ZF 1和ZF18菌株的16S rDNA序列比对 ZF1菌株的16S rDNA PCR产物序列与该属多个种的相似度均很高,与Shigellasp.、Escherichiacoli等相似度均为99%;而ZF18菌株的16S rDNA PCR产物序列与该属多个种的相似度均很高,与Pseudomonassp. hswX21、Bacterium FK2等相似度均为100%,其余均为99%;由于两株菌与序列比对的其他菌属的相似程度均高于99%,因此对两株菌建立系统发育树进行确定。

表4 ZF1菌株的16S rDNA PCR产物在NCBI上进行序列比对Table 4 The sequence alignment of the ZF1 strain

表5 ZF18菌株的16srDNA PCR产物在NCBI上进行序列比对Table 5 The sequence alignment of the ZF18 strain

2.4.3 ZF 1和ZF18菌株系统发育树的构建 利用MEGA5.1软件对ZF1和ZF18两株菌的16S rDNA的核酸序列和BLAST结果中的20个序列进行多重比对并绘制系统进化树。如图5,ZF1与Shigellasp.(志贺氏菌)位于同一个分支上,与其同源性高达99%,具有较进的遗传距离,结合生化鉴定结果分析,将ZF1絮凝菌归属于志贺氏菌菌属。图6中ZF18与Pseudomonasfluorescens(假单胞菌)亲源关系最近,与其同源性达到100%。根据革兰氏染色和生化鉴定等实验结果综合分析,确定ZF18菌株归属于假单胞菌菌属。

图5 ZF1系统发育树Fig.5 The phylogenetic tree of the ZF1 strain

图6 ZF18系统发育树Fig.6 The phylogenetic tree of the ZF18 strain

3 讨论与结论

本研究从山东省临淄区金岭回族镇的水渠中采集水样,经分离、筛选并富集培养后获得2株絮凝性能稳定且活性良好的微生物絮凝菌ZF1和ZF18,其絮凝率分别为为57.68%、57.20%。与周礼等[18]从活性污泥种筛选出一株高效絮凝剂产生菌株,在最佳发酵培养基中絮凝率达95%相比而言,本实验筛选到的菌株仍需深入研究,例如对大颗粒物絮凝率的高低、菌株生长和絮凝所需要的最佳条件和适宜的外界环境的优化处理,絮凝微生物的絮凝分子提取工艺以及絮凝剂的开发利用等[19]。

本实验获得的ZF1(Shigellasp.)属于志贺氏菌菌属,是一类革兰氏阴性杆菌,是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌[20],不仅具有很强的致病力、具有强烈的内毒素且志贺氏菌A群Ⅰ型及部分Ⅱ型菌株还可产生外毒素,后续研究变得较为复杂。ZF18属于荧光假单胞杆菌菌属(Pseudomonasfluorescens),是奶类、蛋类在低温条件下腐败变质的主要细菌之一。在临床上最多见的是血液及血制品被荧光假单胞菌污染,当病人输入了被荧光假单胞菌污染的血液及血制品后,可出现败血症、感染性休克和血管内凝血等严重后果。随着我国城市化进程的不断加快和经济迅速发展,工业废水、生活污水、畜业废水产生以及排放量都在不断地增加。所以,污水处理的问题也变得十分严峻,势在必行。现阶段,微生物絮凝剂对于污水处理的效果十分良好而且不容易产生污染[21]。在广大废水处理方式中,微生物絮凝剂凭借该优势脱颖而出,污泥脱水率从75.60%提高到84.2%,污泥含水率从95.82%降至76.21%[22]。可见,我们的研究不仅丰富了污水中絮凝微生物的品种,而且在后期治理污水等方面研究也有一定借鉴价值和应用潜力。