Fengycin对苹果青霉病致病菌扩展青霉产展青霉素的抑制机制研究

付瑞敏1,2,张利娟3,张 红1,陈五岭

(1.河南财政金融学院,河南郑州 450046;2.西北大学生命科学学院,陕西西安 710069;3.黄河科技学院,河南郑州 450000)

扩展青霉(Penicilliumexpansum)作为苹果采后病害的主要致病菌,它的感染不仅会引起果实严重腐烂,其次级代谢产物展青霉素(patulin,PAT)还会危害人体健康,造成极为严重的食品安全问题[1]。因此,既能有效抑制扩展青霉又能去除展青霉素的技术产品的研发成为当前苹果采后贮藏及加工领域中的研究热点[2]。本课题组前期采用原位分离及N+注入诱变技术选育出1株可有效抑制扩展青霉的生物拮抗菌B.amyloliquefaciensBA-16-8[3]。通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)、质谱((mass spectrometry,MS)、基因敲除和果实生防试验,分析该拮抗菌代谢产物中的主要抑菌成分,发现生防菌B.amyloliquefaciensBA-16-8抑制扩展青霉的关键物质是脂肽类抗生素Fengycin[4]。

Fengycin对丝状真菌有很强的抑制作用[5],它不仅可以作用于扩展青霉的细胞膜,使其通透性发生改变,还可以结合在扩展青霉的核酸上,并抑制其线粒体复合酶相关基因的表达,进而对扩展青霉的呼吸形成抑制并阻碍其蛋白质、糖类代谢[6]。

前期研究发现菌株B.amyloliquefaciensBA-16-8的无细胞发酵液可以使P.expansum分泌的毒素积累量下降,但究竟是抑菌关键物质Fengycin降解了展青霉素还是抑制了P.expansum对展青霉素的合成,具体作用机制尚未明确[7]。而将BA-16-8的无细胞发酵液直接与展青霉素混合后发现,展青霉素含量并没有发生明显变化,说明BA-16-8对展青霉素是不具有降解作用的。因此,推测导致扩展青霉发酵液中毒素积累量下降的原因可能有2点:一则是菌株BA-16-8抑制了扩展青霉的生长,进而导致毒素产量的下降;二则是菌株BA-16-8抑制了扩展青霉的产毒能力,即阻碍了扩展青霉在合成展青霉素的过程中某些基因的表达,从而导致了毒素积累量的下降[8-9]。

为验证第一种可能性,探讨B.amyloliquefaciens代谢产物Fengycin对P.expansum表达展青霉素的影响效果,本实验采用HPLC法检测单位质量P.expansum菌丝体产展青霉素的含量,再用SYBR GreenI Real-time PCR分析合成展青霉素的2个关键基因6-MSAS和IDH[10-14]在不同浓度Fengycin作用下的表达水平,以明确Fengycin对展青霉素的抑制机制。若第一种可能性成立,则单位质量的扩展青霉菌丝体中的毒素积累量应该不会随着Fengycin的处理而发生变化,旨在为Fengycin的开发利用及将其用于苹果采后生物防治提供相应的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Fengycin 本实验室分离纯化,纯度达91.28%[6];Trizol 美国Invitrogen公司;Patulin标准品 Sigma公司;RNA提取试剂盒 美国Promega公司;反转录PCR试剂盒(first strand cDNA Synthesis Kit)、SYBR Green荧光染料试剂盒 Takara公司;乙醇、异丙醇等 国产分析纯。

PDA(马铃薯平板)改良配方:200 g马铃薯(去皮)煮出汁,100 mL脱脂牛乳(0.6%),5 g酵母膏,15 g琼脂,加水至1000 mL,pH为7.0;PDB(马铃薯液体培养基)配方:200 g马铃薯(去皮)煮出汁,100 mL脱脂牛乳(0.6%),5 g酵母膏,加水至1000 mL,pH为7.0。

Applied Biosystem 7500 Real-Time PCR System(美国ABI公司);Light Cycler 2.0实时定量PCR仪 罗氏公司;Aqilent HPLC 1200高效液相色谱分析系统、C18反相柱、ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical Column(5 μm,4.6 nm×250 mm)色谱柱 美国安捷伦。

1.2 实验方法

1.2.1P.expansum的培养与预处理 用PDB液体培养基在30 ℃ 180 r/min条件下培养扩展青霉(P.expansum)。48 h后,将得到的扩展青霉培养液用双层纱布过滤,于10000×g离心5 min,收集离心所得沉淀并将其转接到PDB培养基中制备扩展青霉(P.expansum)菌丝体及孢子悬浮液。用血球计数板将所制备的孢子悬浮液的孢子浓度调整至102个/mL后待用。

1.2.2P.expansum单位质量菌丝体产展青霉素的检测

1.2.2.1P.expansum菌丝体的液体发酵培养 在1.2.1制备的102个/mL的扩展青霉孢子悬液中加入一定量Fengycin,使其最终浓度为50 μg/mL,以未加入Fengycin的孢子悬液为对照。在30 ℃条件下,分别将加入Fengycin的孢子悬液和未加入Fengycin的孢子悬液置于转速为180 r/min的摇床上,振荡培养7 d。将所得培养液于10000×g离心5 min,取上清液进行展青霉素的检测。同时将所得沉淀经过冷冻干燥后进行称质量,待用。

1.2.2.2 扩展青霉发酵液中展青霉素的提取 将20 mL乙酸乙酯加入20 mL 1.2.2.1中的上清液中,于180 r/min将其振荡3 h,使二者充分混匀后进行离心处理(3000×g,3 min),取上清液,从上清液中取20 mL,再加入20 mL乙酸乙酯,将其于180 r/min振荡3 h,使其充分混匀,于3000 g离心3 min后,弃去沉淀,将2次离心所得上清液合并,在40 ℃下用氮气吹吸以吹干乙酸乙酯,再用1 mL乙酸盐缓冲液溶解,用0.25 μm滤膜过滤后,注入HPLC小瓶中,待测。

展青霉素的检测采用C18反相柱,检测所用波长为276 nm,调整柱温为35 ℃,流动相A[乙腈含0.1%三氟乙酸(TFA)]:流动相B(水含0.1%TFA)为1∶9 (v/v),流速为1 mL/min,进样量为20 μL,对标样和样品等量进样20 μ L,用外标法定量。

1.2.2.3 单位质量扩展青霉菌丝体中所含展青霉素的检测 参照公式(1)进行展青霉素含量的测定。

C=S/Sm×C标样

式(1)

式中:C为待测样品展青霉素含量,mg/L;S为待测样品展青霉素面积,mm2;Sm为标样展青霉素面积,mm2;C标样为标样展青霉素含量,mg/L。

1.2.3P.expansumRNA的提取及反转录PCR 取上述离心所得沉淀,用液氮研磨成粉末。用RNA提取试剂盒提取扩展青霉的总RNA,整个试验设置3个平行。提取结果用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测并采用凝胶成像系统进行观察。如果D260/D280值为1.8～2.0,则表明RNA纯度较高,未被DNA污染。反之,则需要进行DNA去除试验。将所提取的已经通过RNA纯度评价的RNA用于反转录PCR。采用TaKaRa的反转录PCR试剂盒合成cDNA第一链,,离心后得到cDNA。

采用痕量核酸分析仪检测所提样品在260、280 nm处的吸光度D260、D280,根据检测结果计算D260/D280值,再根据该比值评价所得RNA的纯度及是否被DNA污染。

表1 试验所用引物信息Table 1 Primer information

反应体系为10 μL:2 μL MgCl2,1 μL 10×RT Buffer,3.75 μL RNase Free dH2O,1 μL dNTP Mixture,0.25 μL RNase Inhibitor,0.5 μL AMV Reverse Transcriptase XL,0.5 μL Oligo dT-Adaptor Primer,1 μL总RNA。反应过程为:30 ℃ 10 min,42 ℃ 20 min,99 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min,1个循环。

表3 Real-Time PCR反应程序Table 3 Real time PCR procedure

1.2.4 SYBR Green I Real-time PCR

1.2.4.1 PCR引物设计及合成 在SYBR GreenI Real-time PCR中,为了避免试验过程中由于RNA的定量、加样以及PCR反应体系中扩增速率不均一所导致的误差,通常需要设置内参。在本试验中,用于SYBR GreenI Real-Time PCR扩增的3个基因分别是P.expansum的展青霉素合成基因6-MSAS、IDH以及内参基因18S rDNA。其中,用于扩增6-MSAS、IDH的引物是根据美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)网站上GenBank中P.expansum的展青霉素合成基因6-MSAS和IDH的基因序列,采用软件Primer Selection 3.0设计的。用于扩增内参基因的引物采用的是真菌通用引物,引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2.4.2 SYBR GreenI Real-time PCR 确定引物后,进行Real-time PCR[15]。反应模板采用1.2.3中制备的cDNA。

整个反应采用ABI公司的Power SYBR Green Master Mix。PCR反应体系及反应过程分别如表2、表3所示。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR所得产物,并得出溶解曲线。

表2 Real-Time PCR反应体系Table 2 Real-time PCR reaction system

1.2.4.3 18S rRNA标准曲线的建立 将未经Fengycin处理的对照组扩展青霉菌丝体RNA通过反转录得到的cDNA进行梯度稀释,对不同稀释度的cDNA中的内参基因18S rDNA进行SYBR Green I Real-time PCR,同时构建相对定量标准曲线。曲线纵坐标为循环阈值Threshold(CT),横坐标为对应RNA相对浓度的对数。

1.3 数据处理

Real-time PCR结束后,通过ABI7500SDS软件对所得到的数据进行分析,同时统计目标基因6-MSAS、IDH以及内参记忆18SrDNA的CT值。试验组、对照组各基因的相对表达量均采用公式(2)的2-ΔΔCT法进行计算。

ΔΔCT=(CT试验组靶基因-CT试验组内参)-(CT对照组靶基因-CT对照组内参)

式(2)

本试验中涉及的数据处理及对数转换均采用SAS统计软件,试验结果的差异性检测采用t检验法。其中,P<0.05表示差异显著(*),P<0.01表示差异极显著(**)[15]。

2 结果与分析

2.1 Fengycin对P. expansum产毒的影响

为了验证是否是菌株BA-16-8抑制了扩展青霉的生长,进而导致毒素产量的下降,采用HPLC检测了Fengycin处理下单位质量扩展青霉的菌丝体中展青霉素的积累量,如果第一种可能性成立,则单位质量的扩展青霉菌丝体中的毒素积累量应该不会随着Fengycin的处理而发生变化。

如图1A,在276 nm波长处,展青霉素的保留时间是7.743 min。通过对比图1B和图1C,发现经50 μg/mL Fengycin处理后的试验组中扩展青霉的单位质量菌丝所产展青霉素明显低于对照组。处理组和对照组的单位质量菌丝体中展青霉素的含量如图2所示,P.expansum在Fengycin的影响下,实验组(TR)的PAT明显低于对照(CK)。与对照相比,经过Fengycin处理后,单位质量的扩展青霉菌丝体中展青霉素的积累量有显著下降(P<0.05),表明Fengycin在抑制病菌活性的同时,对其毒素的合成也有抑制功能。

图1 展青霉素的高效液相色谱结果Fig.1 HPLC chromatograms of PAT注:A:展青霉素标品;B:从对照P. expansum培养液中提取的展青霉素含量;C:从经Fengycin处理的P. expansum培养液中提取的展青霉素含量。

图2 Fengycin对P.expansum产展青霉素含量的影响Fig.2 Effect of Fengycin on the production ofPAT produced by Penicillum expansum注:TR:经过Fengycin处理的样本;CK:对照样本。

2.2 Fengycin对P.expansum 6-MSAS和IDH基因转录产生的影响

2.2.1 菌丝体总RNA质量检测 由图3可以看出,实验组和对照组条带清晰,其中18S RNA、28S RNA条带尤为清晰,表明总RNA完整度较高且没有降解。经过分析对比D260/D280值,发现其结果介于1.8～2.0之间,表明所提取的RNA纯度可用于PCR扩增[15]。

图3 P. expansum总RNA的电泳结果Fig.3 Electrophoresis of total RNAextracted from Penicillum expansum注:M:marker;T:经Fengycin处理的P. expansum;C:对照;图4同。

图4 P.expansum 18S rDNA PCR电泳结果Fig.4 Electrophoresis of total 18s rRNAextracted from Penicillum expansum

2.2.2 内参基因对cDNA模板的检测 由图4可以看出,以处理组、对照组的cDNA为模板PCR扩增出的内参基因18S rDNA 扩增产物具有明亮且单一的条带,无明显的二聚体和非特异性扩增条带,且大小与目的条带一致(约110 bp),表明所提取的扩展青霉的总RNA经反转录所得到的cDNA质量优良,无基因组污染,可作为接下来Real-time PCR试验中检测基因表达的模板使用。

2.2.3 引物特异性检测 对3个基因进行实时荧光PCR反应来检测设计引物的特异性,其熔解曲线见图5。观察到6-MSAS、IDH和内参基因18S rDNA在图5中只有1个单一的峰。这表明本试验中设计的PCR引物是具有特异性的,可以用于检测基因的表达情况。

图5 P. expansum中3个基因的熔解曲线Fig.5 The melt curves of three gene in Penicillum expansum

2.2.4 内参基因18S rDNA荧光PCR扩增曲线及标准曲线构建 对内参基因18S rDNA进行10倍梯度稀释,其浓度分别为1.2×106、1.2×105、1.2×104、1.2×103、1.2×102、12 IU/mL,选取各浓度内参并优化反应条件后以其为模板进行PCR反应。反应结束可得到相应的“S”形荧光定量PCR扩增曲线。该扩增曲线见图6a。以对应RNA的相对浓度的对数为横坐标、以循环阈值Threshold(CT)为纵坐标,得到18S rDNA的标准曲线(图6b)。由图6可以看出,内参基因的标准曲线R2=0.996,说明条件符合定量要求[12],可以使用法对基因的表达量进行分析。

图6 内参基因18S rDNA荧光PCR扩增曲线(a)及标准曲线(b)Fig.6 Amplification curve(a)and standard curve(b)of18S rDNA by real-time PCR

2.2.5 Fengycin对P.expansum目的基因mRNA表达水平的影响 采用法[15]分析Fengycin对P.expansum目的基因6-MSAS、IDH的mRNA表达水平的影响。

通过内参基因18S rDNA进行校正,以对照组中6-MSAS、IDH的mRNA表达水平为基准,对加入Fengycin处理后试验组中P.expansum菌丝体的6-MSAS、IDH的mRNA表达水平的变化情况进行定量分析。由表4可以看出,Fengycin的处理可导致扩展青霉菌丝体中6-MSAS的表达水平显著降低,其表达水平仅为对照组的0.11倍,差异极显著;IDH的表达水平并未因Fengycin处理而发生明显变化,其表达量为0.93,虽然略微有些降低,但差异不显著。

Fengycin对扩展青霉合成展青霉素基因的表达有负调控作用。展青霉素生物合成第一步反应是81分子的乙酰基辅酶A和3分子的丙二酰基辅酶A合成六甲基水杨酸(6-methylsalicylic acid,6-MSA),该反应是由基因6-MSAS所编码的六甲基水杨酸合酶所催化的,这说明展青霉素的合成需要有丙二酰基辅酶A的参与[16-17],而丙二酰基辅酶A又同时是乙酰基辅酶A合成脂肪酸所必需的,因此丙二酰基辅酶A无论在脂肪酸的生物合成、延伸还是在展青霉素等聚酮类物质的合成过程中都起着至关重要的作用,而Fengycin作为脂肽类抗生素,其化学机构中是有脂肪酸链的[18],因此推测Fengycin的生物合成与展青霉素的生物合成存在着对丙二酰基辅酶A的竞争关系,Fengycin有可能是通过该竞争性抑制机制来降低六甲基水杨酸合酶基因6-MSAS的表达,进而降低展青霉素的合成量。该推测也通过另一个基因IDH的表达情况得以进一步证实。研究中发现,展青霉素合成途径中另一个关键基因IDH的表达情况并未因Fengycin的处理而出现明显变化。

表4 Fengycin对P. expansum目标基因mRNA表达水平的影响Table 4 Effects of Fengycin on the mRNA expressionlevel of target genes of Penicillum expansum

3 结论

结果表明,经过Fengycin处理后,单位质量的扩展青霉菌丝体中展青霉素的积累量有显著下降,扩展青霉展青霉素合成关键基因6-MSAS表达水平极显著降低,只有对照组的11%。而IDH的表达水平略有下降,但不显著,为对照组的93%。由此可知Fengycin可能通过抑制扩展青霉6-MSAS的基因表达而抑制展青霉素的合成。针对细菌的抗菌脂肽Fengycin与P.expansum毒素合成之间关系的研究,有助于寻找更为有效的途径抑制真菌及其毒素的产生,对于苹果采后青霉病的防治及苹果副产品中展青霉素的去除具有重要的意义。