参灵口服液的研制及其提高免疫力作用的研究

2019-11-28王小敏郭丽丽刘雅俪张朔生

山西中医药大学学报 2019年5期

秦楠，王小敏，郭丽丽，刘雅俪，张朔生

（山西中医药大学制药与食品工程学院，山西晋中030619）

参灵口服液是采用具有提高免疫功能的药食同源植物和保健食品原料三七、西洋参、灵芝、甘草、黄芪、枸杞、梅花鹿茸，开发的一种具有提高机体免疫力作用的口服液。其中，西洋参、灵芝与黄芪为我国卫生部2018年新增药食同源原料。三七，又名金不换，为五加科多年生草本植物，主要有效成分为三七皂苷，具有止血散瘀、消肿定痛的功效［1］。西洋参属人参的一种，是补气首选药，含有多种人参皂苷、挥发油、糖类、氨基酸和无机元素等，能够抗缺氧、抗疲劳，增强机体的适应能力和免疫力［2-3］。赵珺彦等［4］以小鼠为实验对象，研究发现西洋参提取物对其有增强免疫力的作用。灵芝主要含有三萜类化合物、多糖类、核苷类、生物碱类、氨基酸多肽类、无机元素、脂肪酸等，其中，多糖作为主要生物活性物质之一，具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等作用［5］。枸杞中富含的多糖是枸杞中最主要的活性成分，具有抗疲劳、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、保肝、促进免疫等作用［6］。黄芪主要成分为苷类、黄酮类、多糖、氨基酸等，侧重补虚，具有固表、保肝利尿、降压抗菌、抗衰老、抗应激、增强机体免疫功能等作用［7］。Cho WCS等［8］发现黄芪多糖能恢复高龄小鼠体内的淋巴细胞增生反应，从而表现出免疫恢复作用。鹿茸是雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，富含丰富的氨基酸、多肽类、糖类、维生素、微量元素和甾类化合物等。鹿茸多糖（PAPS）作为鹿茸的主要活性成分，具有调节淋巴细胞、增强机体免疫能力、保护肝损伤及抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等多种生物活性［9-11］。甘草气微，味甜而特殊，主要成分有甘草酸、甘草苷等，作为甘草中最重要的生理活性物质，具有保肝降酶、抗菌、抗病毒抗炎和免疫调节等作用［12-14］。

本实验将上述中药材利用超声提取得到总皂苷和总多糖，将两者进行科学配伍并添加辅料，通过正交试验方法研制出参灵口服液，并对口服液提高机体免疫力作用进行了初步探讨，为实际生产提供理论基础与数据支持，具有一定的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试药与试剂三七、西洋参、灵芝、甘草、黄芪、枸杞、马鹿茸购自亳州。葡萄糖标准品、芦丁标准品（上海士锋生物科技有限公司）；无水乙醇、NaOH、A（lNO3）3、浓硫酸、苯酚、石油醚、正丁醇、苯甲酸钠、纯化水。

1.1.2 动物与仪器清洁级昆明种小鼠（14～18 g）40只，雌雄兼用，实验前小鼠在动物房适应3 d。AR423CN电子天平，奥豪斯仪器有限公司；HH-2数据恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；DZTW电子调温电热套，天津市工业电器厂；GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；RRHP-100型万能高速粉碎机，欧凯莱芙（香港）宝业公司；KQ-100E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TGL-20B飞鸽牌系列离心机，上海安亭科学仪器厂；SHZ-D（III）循环水式真空泵，巩义市子华有限责任公司；UItra-3660紫外分光光度仪，北京普源精电科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 参灵口服液的制备

1.2.1.1 工艺流程灵芝、马鹿茸、枸杞、黄芪、甘草磨粉→过筛→石油醚浸泡→超声提取→sevage除蛋白→醇沉→浓缩→总多糖（A）；三七、西洋参磨粉→过筛→乙醇浸泡→超声提取→石油醚、正丁醇萃取→浓缩→总皂苷干膏（B）；A、B混合→调配→均质（木糖醇、蜂蜜、柠檬酸、稳定剂）→脱气→杀菌→冷却→成品→灌装。

1.2.1.2 总多糖与总皂苷提取率的测定提取率=（浓度×体积）/药粉体质量×100%。

1.2.1.3 多糖皂苷溶液澄清处理将多糖与皂苷干膏1∶1混合，加水调节至料液比 1∶20，备用。澄清剂法:在多糖皂苷溶液中加入1%的壳聚糖澄清剂（以1%的醋酸作为溶剂配制而成）静置24 h［15］，取上清液，加入 0.2%的苯甲酸钠，调节 pH 至4.5，备用。离心分离法［16］:多糖皂苷溶液离心15 min，5000 r/min，取上清液，加入 0.2%的苯甲酸钠，调节 pH 至 4.5，备用。沉降分离法［16］:多糖皂苷溶液在冰箱冷藏静置24 h，取清液，加入0.2%的苯甲酸钠，调节 pH 至 4.5，备用。

将所得的3种液体灌装灭菌，避光放置15 d，观察沉淀情况及澄明度，同时进行多糖含量的检测，结合多糖损失率确定最佳澄清工艺。

1.2.1.4 口服液复配实验随机挑选20名食品专业同学对参灵口服液进行感官评价，以感官评分为考察指标，选用料液比（多糖皂苷与水）、木糖醇、蜂蜜及柠檬酸4个因素，进行L9（34）正交设计，筛选参灵口服液配方。

表1 正交试验因素与水平表

1.2.1.5 感官评价感官评价小组共20人，以口感、外观、气味作为评定指标，采用百分制对产品感官质量进行评定，评分标准见表2。

表2 感官评分标准

1.2.1.6 理化指标检测相对密度、pH:分别采用相对密度测定法-比重瓶法及pH测定法。总糖:用苯酚-硫酸法测定［17］。总皂苷含量:以三七皂苷R1标准品采用比色法进行测定［18］。总黄酮:拟采用《中国药典》2015版一部附录“紫外-可见分光光度法”对3批口服液总黄酮含量进行测定［19-20］。

1.2.2 参灵口服液提高机体免疫力实验［21-23］

1.2.2.1 对免疫器官指数的影响取小鼠 40只，随机分为4组。治疗组分别给予低（0.2 mL/10 g）、中（0.3 mL/10 g）、高剂量（0.4 mL/10 g）参灵口服液；空白对照组给予等体积的生理盐水。灌胃1次/d，连续灌胃10 d，于末次灌胃后次日，处死小鼠，称体重，取脾脏、胸腺、肝脏称湿重，以胸腺或脾脏的体质量（mg）与小鼠体质量（g）之比作为胸腺或脾指数。

1.2.2.2 ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验各组小鼠无菌取脾，制脾细胞悬液，用RPMI1640完全培养液调整脾细胞浓度为3×109个/L，按照MTT法进行淋巴细胞增殖反应，最后在752紫外可见分光光度计570 nm波长处测其吸光度值（A），计算ConA+与ConA-各孔的吸光度。

1.3 统计学方法

所有实验数据均采用Excel 2003、SAS 8.0和Design-Expert（version8.0.6）统计软件进行处理分析，应用最小差异显著法（LSD）进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 澄清工艺的选择

经过15 d的避光静置，3种不同方法的澄清结果见表3。

表3 澄清方法及结果分析

根据试验结果可知，澄清剂法对多糖等有效成分有较强的吸附作用，损失较大，离心法对某些有效成分有所损失，所以试验选择沉降分离法。

2.2 正交试验结果

4个因素对试验结果影响程度的主次关系是A＞D＞B＞C，说明影响口服液口感的主要因素是料液比，其次是柠檬酸，木糖醇和蜂蜜次之。正交试验优化结果显示，最佳工艺配方组合为A3B3C2D2，即料液比 1∶20，木糖醇 1.4 g，蜂蜜 1.0 g，柠檬酸0.04 g。在此工艺基础上制备的参灵口服液色泽棕褐色，澄清透明，色泽均匀，无明显杂质沉淀，酸甜适口。相对密度 1.17（≥1.16）符合口服液标准，pH5.5，总糖 14.20%～14.25%，总皂苷 1.21%～1.34%，总黄酮 1.12%～1.14%。结果见表 4～表 5。