水翁花对内毒素致休克小鼠血清中NO、TNF-α含量的影响

罗 清，戴卫波，谢建文，高玉桥，胡 莹

（1.广州中医药大学附属中山中医院，广东中山528400； 2.四会市中医院，广东四会526200）

水翁花为桃金娘科水翁的干燥幼嫩花蕾，《岭南采药录》首次使用水翁花之名，之后大部分文献均袭用此名。其性寒，味苦，归脾、胃经，具有清热解毒，消食滞之功。《广东中药》载:“治外感发热头痛，感冒恶寒发热。”《广西药用植物名录》记载:“治头痛，跌打，蛇伤。”《广西本草选编》载:“治痢疾，肠炎，感冒发热。”［1］广东省民间习惯在夏季作凉茶以解暑。

水翁花主产于广东、海南、广西、福建等省，广东以粤中及中南部市县出产较多。水翁花具有抗炎、解热、镇痛、抑制肠道致病菌、抗诱导癌细胞凋亡、抗炎保肝、降血糖、保护神经细胞活性等药理作用［2-6］，已成为降血糖、降血脂开发热点药。关于水翁花抗内毒素的作用未见报道，本课题组前期从抗内毒素休克死亡率方面做过研究，结果发现水翁花能明显提高内毒素血症小鼠生存率［7］。为了进一步研究水翁花抗内毒素的作用机制，本文进一步对水翁花对内毒素致休克小鼠血清中NO和TNF-α含量的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品与试剂 水翁花药材（广州康圣药业有限公司提供，产地:广东，批号20170603）。制法:准确称取水翁花1.0 kg，加水煎煮2次，第1次2 h，第2次1 h，过滤，合并2次滤液，静置2 4 h，过滤，滤液浓缩至1000 mL（1 mL相当于原生药1.0 g）。大肠杆菌O55B5内毒素（上海西唐生物科技有限公司）；一氧化氮试剂盒（南京建成科技有限公司）；小鼠肿瘤坏死因子-α酶联免疫检测试剂盒（南京建成科技有限公司）。

1.1.2 实验动物 SPF级昆明种小鼠60只，体重18～22 g，广东省医学实验动物中心提供，动物生产许可证号:SCXK（粤）2008-0020。实验环境为广州中医药大学附属中山医院屏障级动物实验室，环境温度为18～22℃，相对湿度40%～70%，动物购进后观察1 w。

1.1.3 主要仪器 UV-2550型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；BS224S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；Muitiskan MLB3酶标仪，热电（上海）仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 取昆明种小鼠60只，雌雄各半。按随机数字表法分为6组，每组10只，正常对照组与模型组灌服等容量生理盐水；地塞米松组注射地塞米松0.02 g/kg；水翁花水提液高剂量组灌服31 g生药/kg，水翁花水提液中剂量组灌服16 g生药/kg，水翁花水提液低剂量组灌服8 g生药/kg。各组均每天灌胃1次，连续给药15 d。

1.2.2 模型建立 于末次给药后1.5 h，除正常对照组腹腔注射等量生理盐水外，其余各组小鼠均腹腔注射大肠杆菌O55B5内毒素60 mg/kg，观察并记录各组小鼠在注射内毒素或生理盐水后3 h内的形态变化和72 h内的生存状况。72 h后将存活小鼠断头取血，3500转/min离心分离血清，于-20℃保存，备检一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。

1.2.3 检测指标 一氧化氮（NO）:按照试剂盒说明书，采用硝酸还原酶法测定小鼠血清中NO含量。肿瘤坏死因子（TNF-α）:按照试剂盒说明书，采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定小鼠血清中TNF-α水平。

1.3 统计学方法

计数资料采用Stata11.1软件，进行方差分析；计量资料采用SPSS19.0 for Windows软件处理，数据用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，进行Dunnet-t检验。

2 结果

2.1 水提液对内毒素休克小鼠生存状况及死亡率的影响

正常对照组注射生理盐水后，水翁花组、模型组、地塞米松组腹腔注射内毒素1 h内，小鼠均活动自如。12 h后水翁花低剂量组、模型组有部分小鼠死亡，水翁花中、高剂量组死亡较少。除正常对照组外，其余组小鼠均出现烦躁不安、耸毛、颤抖、蜷缩及眼睑充血等现象，其中地塞米松组小鼠症状较轻。注射内毒素后的第3天，水翁花组存活小鼠症状有所好转，而模型组小鼠仍有烦躁不安、颤抖、蜷缩等症状，正常对照组小鼠活动自如。

模型组与正常对照组比较，腹腔注射内毒素所致动物死亡率差异有统计学意义（P＜0.01），提示此模型可用于考察水翁花水提液的抗内毒素作用。水翁花水提液高、中剂量组、地塞米松组与模型组比较，腹腔注射内毒素所致动物死亡率差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），其死亡率分别为10%、20%、0%。结果见表1。

表1 水翁花水提液对内毒素休克小鼠死亡率的影响

2.2 水翁花水提液对内毒素休克小鼠血清中NO、TNF-α含量的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠血清NO、TNF-α 含量差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，水翁花水提物中、高剂量组小鼠血清NO、TNF-α 含量下降，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。结果见表 2。

表2 水翁花水提液对内毒素休克小鼠血清中NO、TNF-α含量的影响

3 讨论

内毒素（ET）又称为“热源”，是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的一种脂多糖（LPS）与微量蛋白质的复合物，其中LPS是内毒素活性成分，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克等多种疾病。本课题组前期已从抗内毒素休克死亡率方面做过研究，发现水翁花能明显提高内毒素血症小鼠的生存率。为进一步探讨抗内毒休克死亡的机制，本文研究了水翁花对内毒素致休克小鼠血清NO和TNF-α含量的影响。结果显示水翁花水提液高、中剂量组小鼠血清中NO和TNF-α含量比模型组下降，且动物死亡数明显减少，表明水翁花具有良好的抗内毒素休克死亡的作用。但具体是哪种活性成分发挥抗内毒素作用还有待后期进一步研究。