黄地安消胶囊改善2型糖尿病模型大鼠胰岛细胞功能的作用

郭明飞，高家荣，王建青，姜 辉，张 磊，魏良兵

（1.安徽医科大学第四附属医院，安徽合肥230012； 2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥230038）

T2DM是以高血糖为主要特征，以胰岛细胞功能受损，胰岛素分泌相对不足而引起的内分泌紊乱性疾病［1-2］。其具有高血糖、葡萄糖耐量降低、胰岛素抵抗等特点，同时伴随糖尿病血管病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病等一系列并发症［3］，发病率已成为除心血管疾病和肿瘤之外的第三大非传染性疾病［4］。黄地安消胶囊由葛根、麦冬、黄连、生地等6味中药组成，具有清热润燥、养阴生津之功效，能抑制炎症反应，改善胰岛细胞功能，减轻糖尿病症状［5］。临床应用多年对T2DM患者血糖、胰岛素抵抗等均具有明显疗效［6-7］。本实验以GK大鼠为模型，研究黄地安消胶囊对GK大鼠血清TNF-α和Leptin含量的影响以及对IRS-1基因的调节作用，探讨其改善糖尿病症状的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性SPF级GK大鼠50只，体质量（220±10）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号:SCXK（沪）2012-0002。雄性SPF 级 Wistar大鼠 10只，体质量（220±10）g，购于安徽医科大学实验动物中心，许可证号:SCXK（皖）2011-002。

1.1.2 药物 按处方比例称取适量药材，加10倍量水加热提取1.5 h，倒出滤液后加8倍量的水加热提取1 h，合并滤液，静止24 h后滤去药液残渣，滤液经浓缩干燥制得干浸膏样品，灌胃给药时溶解备用。参芪降糖颗粒，鲁南厚普制药有限公司，批号00115257。

1.1.3 试剂 荧光定量PCR试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；RIPA裂解液、DAPI染色液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购于杭州碧云天生物技术研究所；DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒，北京天根生化科技有限公司。

1.1.4 仪器 D3024R型高速冷冻微量离心机，DragonLab公司；GA-3型血糖仪，三诺生物传感股份有限公司；RM2016型病理切片机，上海徕卡仪器有限公司；JJ-12J型全密封自动脱水机，武汉俊杰电子有限公司；正置荧光显微镜（Nikon Eclipse C1）；7500型荧光定量 PCR仪，美国ABI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 选取尾静脉血测定GK大鼠血糖值，随机血糖值和糖负荷2 h血糖值均大于11.1 mmol/L 作为糖尿病成模标准［8-10］。选取造模成功的大鼠随机分为模型组、参芪降糖颗粒组（1.08 g/kg）、黄地安消胶囊组（12 g/kg，6 g/kg，3 g/kg），每组10只，另取10只Wistar大鼠为正常对照组。给药周期为6 w，给药期间各组大鼠均自由饮食饮水。

1.2.2 血清TNF-α、Leptin含量检测 实验结束前禁食 12 h，用 3.5%的水合氯醛溶液（1 mL/100 g）进行腹腔注射麻醉，腹主动脉取血后静置2 h，3500 r/min离心10 min，取上清液，进行指标检测。

1.2.3 胰腺组织免疫荧光染色 取胰腺组织做常规石蜡包埋，切片、脱蜡、水化等步骤后进行抗原修复，血清蛋白封闭处理，滴加一抗，4℃条件下孵育过夜，经洗涤后，滴加二抗，避光孵育后滴加DAPI复染细胞核，漂洗，封片处理，置于荧光显微镜下观察。

1.2.4 RT-PCR 技术检测脂肪组织 IRS-1 mRNA的表达 取脂肪组织50 mg，Trizol法提取脂肪组织总RNA，经逆转录酶反转录成cDNA，RT-PCR技术检测脂肪组织IRS-1 mRNA的相对表达，以β-actin为内参。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot技术检测脂肪组织 IRS-1 蛋白的表达 取脂肪组织50 mg，破碎处理后，加蛋白裂解液提取总蛋白，凝胶电泳后，电转印至PVDF膜，封闭处理，滴加一抗，4℃孵育过夜，滴加二抗进行孵育，洗膜处理后，HRP-ECL发光法进行鉴定，经曝光、定影等处理，通过凝胶成像系统扫描分析蛋白条带吸光度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0对实验数据进行统计分析，以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 黄地安消胶囊对大鼠血清TNF-α、Leptin含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α，Leptin含量均明显升高（P＜0.01），表明糖尿病大鼠存在炎症反应；与模型组比较，参芪降糖颗粒组及黄地安消胶囊组大鼠TNF-α、Leptin存在不同程度降低（P＜0.01），表明黄地安消胶囊能够降低糖尿病炎症反应。结果见表2。

表2 黄地安消胶囊对大鼠血清TNF-α、Leptin含量的影响（±s）

表2 黄地安消胶囊对大鼠血清TNF-α、Leptin含量的影响（±s）

注:与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01

组别 剂量（g/kg） TNF-α（pg/mL） Leptin（ng/mL）正常组 - 41.69±6.23 4.17±0.51模型组 - 125.50±12.311） 9.95±0.421）参芪降糖颗粒组 1.08 55.09±8.012） 5.79±0.482）黄地安消胶囊高剂量组 12 75.83±6.961） 6.73±0.552）黄地安消胶囊中剂量组 6 45.86±6.592） 5.17±0.392）黄地安消胶囊低剂量组 3 85.34±7.372） 7.15±0.132）

2.2 黄地安消胶囊对大鼠胰岛组织形态学的影响

正常组大鼠胰岛组织结构完整，呈椭圆状，细胞排列紧密，细胞核清晰可见，呈蓝色均匀分布。模型组胰岛细胞排列疏松，形态紊乱，细胞数目较正常组明显减少。参芪降糖颗粒组大鼠胰岛细胞排列较规则，细胞数目较模型组略有增加。黄地安消胶囊各组大鼠胰岛细胞数目较模型组有不同程度增加，细胞排列基本规则，形态较完整，无明显异常现象，结果见图1。

图1 黄地安消胶囊对大鼠胰腺组织形态学的影响（×400）

2.3 黄地安消胶囊对大鼠脂肪组织IRS-1mRNA表达的影响

图2 IRS-1和β-actin溶解曲线

表3 黄地安消胶囊对大鼠脂肪组织IRS-1 mRNA表达的影响 （±s）

表3 黄地安消胶囊对大鼠脂肪组织IRS-1 mRNA表达的影响 （±s）

注:与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01

组别 剂量（g/kg） IRS-1正常组 - 1.00±0.05模型组 - 0.63±0.041）参芪降糖颗粒组 1.08 0.75±0.032）黄地安消胶囊高剂量组 12 0.70±0.052）黄地安消胶囊中剂量组 6 0.75±0.042）黄地安消胶囊低剂量组 3 0.69±0.042）

图3 IRS-1和β-actin扩增曲线

见图2、图3，表3。由图2可知，IRS-1和βactin基因溶解曲线分别在83℃和86℃获得单一溶解峰，表明在该反应条件下，目的基因具有显著的特异性。由图3可知，IRS-1和β-actin基因扩增曲线跨度适中，线条光滑圆润，表明扩增良好。由表3可知，与正常组比较，模型组大鼠脂肪组织中IRS-1mRNA表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，黄地安消胶囊各组及参芪降糖颗粒组大鼠脂肪组织IRS-1 mRNA表达具有不同程度的升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 黄地安消胶囊对大鼠脂肪组织IRS-1蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠脂肪组织IRS-1蛋白表达显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，黄地安消胶囊中剂量组及参芪降糖颗粒组大鼠脂肪组织IRS-1蛋白表达具有不同程度的升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。结果见表4，图 4。

表4 黄地安消胶囊对大鼠脂肪组织IRS-1蛋白表达的影响 （±s）

表4 黄地安消胶囊对大鼠脂肪组织IRS-1蛋白表达的影响 （±s）

注:与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01

组别 剂量（g/kg） IRS-1正常组 - 1.28±0.07模型组 - 0.77±0.031）参芪降糖颗粒组 1.08 0.93±0.062）黄地安消胶囊高剂量组 12 0.71±0.04黄地安消胶囊中剂量组 6 1.07±0.062）黄地安消胶囊低剂量组 3 0.38±0.03

图4 黄地安消胶囊对大鼠脂肪组织IRS-1蛋白表达的影响

3 讨论

糖尿病是一种临床常见的慢性病、多发病，具有高血糖的显著特征，同时易引起糖尿病肾病、糖尿病足、糖尿病视网膜病变和血管病变等一系列并发症。其发病机制复杂多样，多与遗传、自身免疫、环境因素、饮食、精神等因素相关［11］。GK 大鼠为非肥胖型T2DM模型，具有和人类糖尿病相似的高血糖、高血脂、胰岛素抵抗等特征，已成为研究 T2DM 的理想模型［12］。

机体在高血糖状态时易引发体内的炎症因子产生反应，诱发感染等效应，其中以炎症因子TNF-α和Leptin升高较为显著［13-14］。由实验结果可知，黄地安消胶囊对上述炎症因子具有明显的降低作用，表明其能够在一定程度上抑制体内的炎症反应，降低机体发生感染的风险。

胰岛素经分泌入血后，随血液循环到达脂肪、肝脏、骨骼肌等靶组织或靶器官，与细胞膜表面的胰岛素受体相结合，引发胰岛素信号传递的级联反应，促进组织细胞对葡萄糖的吸收和利用，降低体内血糖含量［15］。在这一信号传递过程中IRS-1作为胰岛素信号通路的首要蛋白分子，直接决定着胰岛素与受体底物结合的强弱。在正常大鼠体内IRS-1mRNA和蛋白含量呈正性表达［16］。当机体出现胰岛素抵抗或者血糖升高时，IRS-1基因表达明显降低，胰岛素信号通路传递受阻，外周细胞对葡萄糖消耗减少，机体出现高血糖状态，从而加重糖尿病症状［17］。本实验结果表明，黄地安消胶囊能够促进GK大鼠脂肪组织IRS-1mRNA和蛋白表达，增强机体对胰岛素的敏感性，促进机体对血糖的利用，改善T2DM症状。

综上所述，黄地安消胶囊能够降低糖尿病模型GK大鼠炎症因子含量，增强胰岛素信号通路受体底物IRS-1的基因表达，促进胰岛素信号通路活性，从而增强机体对葡萄糖的利用，降低血糖水平，改善糖尿病症状。