鹰嘴豆芽素A 免疫佐剂作用试验

陈洪博,李培华,蔡 翔,邱龙新

(1.龙岩学院 生命科学学院,福建 龙岩364012;2.福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室,福建 龙岩 364012)

疫苗免疫是防控动物传染病的重要手段之一,近年来疫苗已使用许多亚单位抗原和多肽抗原,此类抗原具有纯度高、安全性好等特点,但免疫原性较差,不能有效的诱导免疫反应,因此使用佐剂来提高其免疫原性具有重要意义。目前应用于畜禽的疫苗佐剂有弗氏佐剂、氢氧化铝等,此类佐剂虽然均可提高疫苗的免疫效果,但在使用的安全性上还存在不足。与合成药物相比,中药具有多效性、双向免疫调节性、不良反应少等特点,因此将中药开发研制成安全有效的疫苗佐剂具有广阔的应用前景。鹰嘴豆芽素A(BiochaninA,BioA)属于黄酮类化合物,是红车轴草中的主要有效成分,红车轴草中含有大量异黄酮和黄酮类物质,其异黄酮是免疫调节剂及免疫刺激剂,具有抗病毒、抗肿瘤及消炎的作用。研究发现红车轴草总黄酮短期内在一定浓度范围内可通过增强巨噬细胞的吞噬能力,增强小鼠特异性免疫功能[1]。BioA 作为红车轴草异黄酮的主要有效成分,目前研究主要集中在其抗肿瘤和抗氧化等方面,研究发现,BioA 可调节细胞因子分泌、减轻肝损伤、保护大脑神经元等[2-4],而有关BioA 的免疫佐剂作用尚未见报道,本试验拟利用不同浓度BioA 与鸡卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)联合免疫小鼠,通过检测免疫小鼠IgG 及其亚型抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖、细胞因子分泌和CD4+、CD8+T 细胞亚群变化,探讨BioA 作为疫苗免疫佐剂的应用前景,从而为开发新的中药佐剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 鹰嘴豆芽素A、OVA、LPS 和ConA(Sigma 产品);HRP 标记山羊抗小鼠IgG 抗体、IgG1抗体、IgG2a 抗体(Abcam 产品);CCK-8 试剂盒(碧云天生物技术有限公司产品);抗小鼠CD3e-PECy5、CD4-FITC、CD8a-PE 单克隆抗体(eBioscience产品);IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ 和TNF-α(上海西唐生物科技有限公司产品);氢氧化铝胶佐剂(中国牧工商集团有限公司产品)。

1.2 实验动物 清洁级雌性ICR 小鼠60 只,体重18～22 g,由上海实验动物中心提供[合格证号：SCXK(沪)2016-0003],饲养于IVC 独立送风饲养笼具,饲喂高压灭菌饲料和水,室内温度25±5 ℃,湿度50%±10%,适应性饲养1 周后开始试验。

1.3 分组及免疫程序 将60 只ICR 小鼠随机分为6 组,每组10 只小鼠,分别是空白对照组(生理盐水)、OVA 抗原组、OVA 抗原加铝胶佐剂组(200 μg/只)、OVA 抗原加BioA 低剂量组(50 μg/只)、OVA抗原加BioA 中剂量组(100 μg/只)和OVA 抗原加BioA 高剂量组(200 μg/只),OVA 注射量为10 μg/只,每只小鼠皮下注射0.1 mL OVA 抗原+0.1 mL不同浓度的样品,小鼠首免后21 d 进行二次免疫,二免后2 周杀小鼠用于后续试验。饲养过程中同时观察2 次免疫后小鼠精神状态和行为变化,记录试验结束前1 d 小鼠体重。

1.4 IgG 及其亚型检测 间接ELISA 法检测抗OVA 抗体IgG、IgG1 和IgG2a 水平,具体方法参考文献[5]。

1.5 淋巴细胞增殖检测 无菌操作取小鼠脾脏,制备淋巴细胞悬液,调整细胞浓度到2.5×106个/mL备用。培养液LPS 终浓度为7.5 μg/mL,ConA 和OVA 终浓度为10 μg/mL,设置阴性对照和空白对照。培养72 h,培养结束前4 h 加入10 μL CCK-8,酶标仪测定OD450nm值。淋巴细胞刺激指数(Stimulationindex,SI)=(OD刺激孔-OD空白孔)/(OD未刺激孔-OD空白孔)。

1.6 血清细胞因子浓度测定 按照ELISA 试剂盒操作步骤,检测血清中IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ 和TNF-α 浓度。

1.7 外周血淋巴细胞亚群测定 收集小鼠肝素钠抗凝外周血,取100 μL 抗凝血裂解红细胞,洗涤并重悬细胞,用BD FACS Calibur 流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+比值变化,FlowJo 7.6软件分析试验结果。

1.8 数据分析 试验结果表示为平均值±标准差,使用SPSS 20.0 软件单因素方差分析和LSD 法进行组间比较,P＜0.05 代表差异显著,P＜0.01 代表差异极显著。

2 结果

2.1 临床观察 一免和二免后小鼠的精神状态、活动能力及皮毛状态等均无异常变化;试验结束前1 d称重,与对照组相比,各佐剂组小鼠的体质量均未见显著变化,表明BioA 和铝胶佐剂对小鼠的体重变化无明显影响。

2.2 抗OVA 特异性抗体IgG、IgG1 和IgG2a 的检测 OVA 抗原与BioA 共免疫小鼠抗体水平检测显示,二免后铝胶组和BioA 组IgG 抗体水平极显著高于OVA 组(P＜0.01),铝胶组IgG 抗体水平高于BioA 组,但无显著差异,BioA 中剂量组IgG抗体水平高于低剂量组高剂量组,但三组之间无显著差异(图1A)。IgG1 抗体浓度检测结果表明,与OVA 组相比,铝胶组和BioA 组极显著升高(P＜0.01),铝胶组IgG1 水平显著高于BioA 组(P＜0.05),BioA 三组之间无显著差异,但中剂量组IgG1 抗体水平最高(图1B)。IgG2a 抗体浓度检测结果表明,与OVA 组相比,BioA 中剂量组抗体水平显著升高(P＜0.05),其他组与OVA 组相比有升高趋势但差异不显著(图1C)。

2.3 淋巴细胞增殖试验结果 小鼠免疫BioA 100 μg 后,脾脏淋巴细胞体外受ConA、LPS 和OVA 刺激产生的淋巴细胞增殖能力显著或极显著高于OVA 组(P＜0.05 或P＜0.01);与OVA 组相比,BioA 低剂量组和高剂量组脾脏淋巴细胞受ConA 刺激后增殖能力显著升高(P＜0.05)。与OVA 组相比,铝胶佐剂组和BioA 组脾脏淋巴细胞接受OVA 刺激后淋巴细胞增殖水平有升高,但差异不显著(图2)。

2.4 细胞因子浓度检测结果 与OVA 组相比,BioA组和铝胶组均能显著提高IL-2、IL-4 的浓度(P＜0.05),铝胶组的表达量要高于BioA 组,但二者之间无显著差异;BioA 能显著提高IFN-γ、TNF-α 的浓度(P＜0.05),而铝胶组能提高IFN-γ、TNF-α 的表达,但与OVA 组相比无显著差异;BioA 组和铝胶组均能提高IL-5 的浓度,但与OVA 组相比无显著差异(图3)。

图1 小鼠血清IgG 抗体及其亚型水平

图2 小鼠脾脏淋巴细胞增殖结果

图3 小鼠血清细胞因子检测结果

2.5 T 淋巴细胞亚群的检测 OVA 组、铝胶组和BioA 组CD4+和CD8+T 淋巴细胞检测结果分别如图4C、4D 和4E 所示,结果显示,与OVA 组比较,OVA联合BioA 或铝胶极显著或显著升高小鼠外周血中CD4+T 淋巴细胞比例(P＜0.05 或P＜0.01),BioA组较铝胶组略有升高,但两组之间差异不显著;与OVA 组比较,OVA 联合BioA 或铝胶可降低CD8+T淋巴细胞的比例,但三组之间差异不显著;同时,铝胶组和BioA 组CD4+/CD8+T 淋巴细胞的比值也显著或极显著升高(P＜0.05 或P＜0.01);与OVA 组和铝胶组相比,BioA 组CD3+/CD4-/CD8-细胞数量显著降低,表明BioA 可刺激机体淋巴细胞的分化。

3 讨论

新一代的疫苗,特别是那些基于重组蛋白和DNA 疫苗,可能会比传统疫苗的反应原性和免疫原性弱,因此,迫切需要开发和改进疫苗佐剂。佐剂对机体免疫反应有显著影响,可使机体免疫系统趋向于Th1 或Th2 免疫类型[6-7]。虽然在临床生产中疫苗已经使用了多种佐剂,但这些佐剂大多只引起Th2 型抗体反应,或有不良副作用,限制了它们在疫苗中的潜在应用[8-10]。目前常用的佐剂主要刺激Th2 型免疫应答,不能刺激CTL 产生,此种免疫反应通常对细胞内病原体无效,Th1/Th2 型免疫应答很大程度上依赖于佐剂类型[11-13]。

图4 外周血中CD4+和CD8+T 淋巴细胞的表达

本试验中BioA 和OVA 抗原联合免疫小鼠后,可提高IgG 抗体水平,且具有剂量依赖性,100 μg 剂量组效果最佳,然而表达量低于铝胶组,但两者之间无显著差异;铝胶组和BioA 组均极显著提高IgG1 的表达(P＜0.01),与BioA 组相比铝胶组IgG1 的表达量显著升高(P＜0.05);BioA 100 μg 剂量组可显著提高IgG2a 表达量(P＜0.05),而铝胶对IgG2a 的表达量无显著影响。IgG 抗体及其亚型检测结果表明铝胶佐剂能显著诱导Th2 型免疫反应,而对Th1 型免疫反应效果较差,BioA 佐剂在提高Th2 型免疫反应方面不如铝胶佐剂,但对Th1 型免疫反应要优于铝胶。淋巴细胞增殖试验结果表明,BioA 组受ConA、LPS 和OVA 刺激后淋巴细胞增殖能力均显著高于OVA 组(P＜0.05),因此,BioA能同时刺激T、B 淋巴细胞的增殖。细胞因子检测结果表明,BioA 可提高Th1 型细胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)和Th2 型细胞因子(IL-4)的表达量,而铝胶佐剂对Th2 型细胞因子(IL-4)的表达量显著升高,对Th1 型细胞因子(IFN-γ 和TNF-α)的表达无显著作用,提示BioA 佐剂可诱导机体Th1 和Th2 型免疫应答反应,有助于细胞免疫体液免疫的产生。

CD4+T 细胞能调控和辅助其他淋巴细胞发挥功能,CD8+T 细胞具有免疫抑制和细胞毒性作用,CD4+/CD8+比值是判断机体免疫功能状态的重要指标,正常小鼠CD4+/CD8+比值为1～ 2[14-15]。本研究中BioA 佐剂能显著增加CD4+T 细胞表达(P＜0.05),对CD8+T 细胞表达无显著影响,但CD4+/CD8+值呈升高趋势,机体内CD3+/CD4-/CD8-细胞数量显著降低,表明BioA 可刺激机体淋巴细胞的分化。

本试验结果发现,适当浓度的BioA 能促进机体Th1 和Th2 型细胞活化增殖,提高机体内IgG1 和IgG2 抗体水平,能促进OVA 诱导的细胞免疫和体液免疫反应。综上,本试验表明,BioA 具有免疫佐剂效果。