牛羊场环境气载葡萄球菌浓度及气溶胶粒谱特征分析

刘家祺,白燕雨,熊云梅,郭 耀,乔婷婷,段晋伟,唐 芳,霍乃蕊,古少鹏

(山西农业大学动物科技学院,山西 太谷 030801)

葡萄球菌广泛分布在空气、水和土壤环境中,健康动物的体表和呼吸道中也存在大量的葡萄球菌,感染人、畜后以化脓性炎症为主要特征。牛葡萄球菌病多发于奶牛,引起急慢性乳腺炎,导致生产力严重受损[1];羊体表、呼吸道及消化道受到葡萄球菌(主要是金黄色葡萄球菌)感染一般会引起毛囊炎、皮下脓肿、食物中毒、胃肠炎、气管炎及肺炎等疾病[2]。目前,我国牛、羊养殖业由传统的散养向集约化、工厂化发展,高密度养殖方式加剧了养殖环境的污染,大量的致病性及非致病性细菌气溶胶极易直接或间接引发人、畜的各类疾病[3],动物圈舍内、外细菌气溶胶来源复杂,畜禽自身、粪便、饲料和垫草及空气中悬浮物均可形成细菌气溶胶,威胁动物与养殖场周边居民健康[4]。本试验检测了牛、羊场及外环境四季气载葡萄球菌浓度变化,以及葡萄球菌气溶胶粒谱特点,以期为牛、羊场气载葡萄球菌危害评估和养殖环境控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 牛、羊场概况 牛场：奶牛舍为半开放式,设有运动场,每栋牛舍饲养奶牛100 头,采用自然通风采光。饲养量300 头,专人每天打扫卫生,消毒1 次/周。羊场：羊舍结构为半开放式,无运动场,高床平养,自动出粪,饲养密度为0.5 只/m2,每栋饲养量500 只,自然通风结合风机换气。

1.2 采样地点 分别于牛舍外的上风向10 m、下风向10 m、下风向50 m 及下风向100 m 处各选取1个采样点;牛舍内选取3 个采样点;奶牛运动场选取3 个采样点;在羊场外上风向10 m、下风向10 m、下风向50 m 及下风向100 m 处各选取1 个采样点;羊舍内选取3 个采样点。

1.3 主要试剂及仪器 普通营养琼脂(北京奥博星生物技术责任有限公司,02-276);Baird-Park 琼脂培养基(青岛海博生物公司,HB4115);营养肉汤(Solarbio,N8300);脱纤维绵羊血;Andersen 6 级空气生物收集器(Tisch environment,USA),捕获粒子直径范围见表1。

表1 Andersen-6 级采样器捕获粒子直径范围

1.4 空气样本采集 应用Andersen-6 级空气微生物收集器分别于春、夏、秋、冬四季中连续3 d 采集牛羊场及周围环境的空气样本,并记录当时的气温、相对湿度及风速等环境参数,采样介质为5%绵羊血琼脂,模拟牛、羊呼吸高度进行采样,采样流量28.3 L/min,采样时间为3 min,每点3 次重复,并设空白对照。

1.5 样本的处理(1)分离培养将采样后的5%绵羊血琼脂平板置于37 ℃恒温培养箱内,倒置培养24～48 h。用无菌接种环挑取血平板上的全部菌落,革兰染色镜检后,将镜检为葡萄串状的革兰阳性菌株,接种到BP 培养基上,将生长边缘淡灰色到黑色的菌落计为葡萄球菌;(2)菌落计数依据5%绵羊血琼脂平板生长的菌落数,计算每立方米空气中所含需氧菌及葡萄球菌总数(CFU/m3),计算公式如下：每立方米空气中所含的细菌总数=六级平皿上细菌数÷28.3 L/min×采样时间(min)×1 000。

1.6 数据统计与分析(1)空气中微生物呈非正态分布,本试验气载葡萄球菌含量均使用中间值表示,此统计方式适合此统计方式适合运用在数值较小但波动较大的样本统计,并用最大值和最小值反应各样本之间数值的波动范畴[5],平均值为中间值的平均数。中间值计算公式：

若n为奇数,则Md=X(n+1)/2;若n为偶数,则Md=(Xn/2+Xn/2+1)/2。

(2)细菌气溶胶粒谱特征以计数中值直径(CMD)表示,细菌粒径分布的离散度以几何标准差GSD 表示,人的通气量按6.94×10-3m3/min 计算,牛通气量按1.44×10-1m3/min[6],羊的通气量按5.70×10-3m3/min 计算[7]。

Andersen-6 级空气采样器第Ⅰ、Ⅱ级收集的细菌粒子直径＞6 μm,可进入人畜浅部呼吸道,第Ⅲ～Ⅵ级收集的细菌粒子直径≤5 μm,可沉着在细支气管甚至直接进入肺泡[8]。可进入呼吸道浅部、深部的细菌粒子量分别对应采样器的第Ⅰ、Ⅱ级和第Ⅲ～Ⅵ级。

2 结果

2.1 牛、羊场环境空气中葡萄球菌的浓度

2.1.1 牛场空气中葡萄球菌的浓度 牛场四季环境气载葡萄球菌浓度在0.16×103CFU/m3～4.43×103CFU/m3之间,冬季浓度最高,夏季次之,春季最低,在牛舍、运动场、上风向10 m、下风向10 m、下风向50 m 和下风向100 m 处气载葡萄球菌占气载需氧菌的比例分别为79.14%、71.63%、55.93%、55.93%、62.40%、63.41%。牛舍、运动场、上风向10 m、下风向10 m、下风向50 m 和下风向100 m气载葡萄球菌浓度分别为1.15×103CFU/m3～4.43×103CFU/m3、1.22×103CFU/m3～4.27×103CFU/m3、0.16×103CFU/m3～0.5×103CFU/m3、0.56×103CFU/m3～1.23×103CFU/m3、0.49×103CFU/m3～1.07×103CFU/m3、0.27×103CFU/m3～0.75×103CFU/m3,气载葡萄球菌浓度平均值以牛舍最高,上风向10 m 处最低,在牛舍下风向处的气载葡萄球菌含量随着与圈舍距离增大而逐渐减小,见图1。

图1 牛场气载葡萄球菌含量

2.1.2 羊场空气中葡萄球菌的浓度 羊场四季环境气载葡萄球菌浓度在0.22×103CFU/m3～4.82×103CFU/m3之间,夏季浓度最高,冬季次之,春季最低,羊舍、上风向10 m、下风向10 m、下风向50 m 和下风向100 m 气载葡萄球菌占气载需氧菌的比例分别为74.86%、67.16%、59.30%、67.83%、68.97%。羊舍、上风向10 m、下风向10 m、下风向50 m 和下风向100 m气载葡萄球菌浓度分别为1.27×103CFU/m3～4.82×103CFU/m3、0.22×103CFU/m3～0.81×103CFU/m3、0.74×103CFU/m3～1.96×103CFU/m3、0.28×103CFU/m3～1.5×103CFU/m3、0.27×103CFU/m3～1.19×103CFU/m3,气载葡萄球菌浓度平均值以羊舍最高,上风向10 m 处最低,羊舍下风向处的气载葡萄球菌含量随着与圈舍距离增大而逐渐减小,见图2。

图2 羊场气载葡萄球菌含量

2.2 牛、羊场环境气载葡萄球菌的空气动力学特征

2.2.1 牛场环境葡萄球菌气溶胶颗粒空气动力学特点 牛场环境中葡萄球菌气溶胶颗粒主要分布在采样器的第Ⅵ、Ⅴ级,峰值均出现在第Ⅵ级(2.1～3.3 μm),次峰均在第Ⅴ级(1.1～2.1 μm),第Ⅲ～Ⅵ级占比为72.89%～84.73%,见图3。

图3 牛场各采样点气载葡萄球菌在采样器上的分布

2.2.2 羊场环境葡萄球菌气溶胶颗粒空气动力学特点 羊场环境中气载葡萄球菌主要分布在采样器的第Ⅰ、Ⅳ级,峰值均出现在第Ⅰ级(＞7 μm),次峰均在第Ⅳ级(2.1～3.3 μm);第Ⅲ～Ⅵ级占比为53.33%～62.75%,见图4。

图4 羊场各采样点气载葡萄球菌在采样器上的分布

2.2.3 葡萄球菌气溶胶粒子CMD 和GSD 值 牛场环境葡萄球菌气溶胶粒子CMD 值为2.30 μm～2.67 μm,其中牛舍最低;GSD 为1.85～1.92;羊场环境的葡萄球菌气溶胶粒子CMD 值为3.09 μm～3.56 μm,其中羊场下风向10m 处最低;GSD 为1.68～1.84。

2.2.4 到达人畜呼吸道不同部位的葡萄球菌粒子量 在牛舍中,人和牛每分钟可吸入至肺部深处的葡萄球菌粒子量最高可达16.29 CFU 和337.97 CFU,高于其他采样点,并且在下风向处随着与牛舍距离增大,人畜每分钟可吸入至肺部的葡萄球菌粒子量逐渐减小,详见表2。

表2 牛场环境气载葡萄球菌在呼吸道不同部位的到达量 (CFU/min)

在羊舍中,人和羊每分钟可吸入至肺部深处的葡萄球菌粒子量最高可达11.28 CFU 和9.26 CFU,高于其他采样点,并且在下风向处随着与羊舍距离增大,人畜每分钟吸入至肺部的葡萄球菌粒子量逐渐减小,见表3。

表3 羊场环境气载葡萄球菌在呼吸道不同部位的到达量 (CFU/min)

3 讨论

3.1 牛、羊舍环境四季气载葡萄球菌浓度 牛舍内气载葡萄球菌含量冬季最高,春季最低,与冬季舍内密封较严、风速小、湿度大,舍内通风换气慢,环境适宜葡萄球菌生长有关;春季风速较大,空气流动快,舍内湿度小,气载葡萄球菌含量较低。我们测得牛舍内气载葡萄球菌浓度平均值为2.77×103CFU/m3,远高于段会勇[9]兔舍气载葡萄球菌含量均值2.74×102CFU/m3的测定结果,柴同杰[10]指出的无垫草奶牛舍气载需氧菌浓度应低于2.5×103CFU/m3,葡萄球菌属需氧菌,该牛舍气载需氧菌含量必定超出此界值,需改善环境卫生。

羊舍内气载葡萄球菌浓度夏季最高,春季最低,本试验研究对象是舍饲羊场,羊舍夏季气温较高,舍内通风差,葡萄球菌浓度较高;春季风速大,舍内无动力风机运转较快,环境卫生得到改善。关于羊舍气载需氧菌的最低限量,目前未见报道,但羊舍内气载葡萄球菌含量均值为2.59×103CFU/m3,远高于一般环境。

养殖场气载葡萄球菌浓度夏冬两季较高,春季最低,这与钟召兵[11]研究一致。葡萄球菌是主要的环境细菌,在本试验发现牛、羊舍内气载葡萄球菌含量较高,Crowe[12]等认为,环境中高浓度的气载微生物可造成动物和人员的抵抗力和免疫力下降,对传染性疾病易感性增强,因此必须注重圈舍空气的清洁和消毒。

3.2 牛、羊场气载葡萄球菌的散播 本试验表明,牛、羊舍及其下风向处气载葡萄球菌的含量均随距离养殖场的距离逐渐增大而减小,散播距离超过100 m;柴同杰等[13]在鸡舍下风向(10～400 m)分离的57.1%金黄色葡萄球菌与舍内空气与粪便样本中采集的相同;黄藏宇[14]的研究显示,猪舍内气载需氧菌含量与舍外下风向10 m、20 m、25 m 和30 m处空气无明显差异,以上均表明动物圈舍内气载葡萄球菌可向舍外较大距离散播。圈舍内卫生、饲养密度以及风速、风向等因素均会影响舍内微生物气溶胶传播的距离与强度[15],因此养殖场建设时选址应与居民区保持一定距离。

3.3 牛、羊场气载葡萄球菌空气动力学分析 本试验中使用的Andersen-6 级微生物收集器可根据空气中微生物颗粒直径大小不同而采集在不同的级上,采样器模拟呼吸道可判断微粒到达部位,收集在第Ⅰ、Ⅱ级上的微粒能够侵入鼻咽喉及气管,收集在采样器第Ⅲ到Ⅵ级上的微粒能够沉着在支气管和细支气管最终进入肺泡中[16-17]。所以,依据空气中微生物到达的采样器的不同级,可模拟微粒到达呼吸系统的部位,从而推断气载微生物对人畜健康的威胁程度。

本试验测定结果表明,牛舍内气载葡萄球菌的40.39%、30.54%散布在Andersen-6 级收集器的第Ⅳ、Ⅴ级上,84.73%分布在Andersen-6 级采样器的第Ⅲ到Ⅵ级上,这一部分葡萄球菌能到达人、畜深部呼吸道和肺泡。羊场内气载葡萄球菌的22.55%分布在采样器第Ⅳ级,分布在采样器第Ⅲ到Ⅵ级的气载葡萄球菌占总数的62.75%。李晓霞[18]等对国内医院室内耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的粒度分布研究发现,超过50%的气载金黄色葡萄球菌及其中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均分布在采样器第Ⅲ～Ⅵ级,可直接到达肺部引起感染;于欢[19]等发现,羊舍真菌气溶胶80%分布在采样器第Ⅲ～Ⅴ级,可引起肺炎及毒素中毒;Kim[20]等也认为吸入分布在采样器第Ⅲ～Ⅵ级的微生物后会对人类健康产生严重危害。

牛场及外环境的葡萄球菌气溶胶粒子CMD 值均小于3 μm,且牛舍处最高,提示牛场及外环境葡萄球菌气溶胶粒子可进入人和牛呼吸道深部甚至肺泡的葡萄球菌气溶胶粒子比例最大,粒径分布离散度GSD 较小,说明大量的葡萄球菌可到达人畜呼吸系统深部;羊舍及外环境的葡萄球菌气溶胶粒子CMD 值接近3 μm,且各采样点的GSD 值相差较小,提示羊场气载葡萄球菌可进入人畜呼吸道深部的数量大、浓度高,危害性较大。